福莫特羅對急性馬兜鈴酸腎病的保護(hù)作用及機(jī)制*

★ 劉新輝 李順民（深圳市中醫(yī)院腎病科 廣東 深圳 518033）

馬兜鈴酸腎?。╝ristolochic acid nephropathy，AAN）是攝入含有馬兜鈴酸類成分中草藥而導(dǎo)致的腎小管間質(zhì)疾?。?］。最近中國國家慢性腎臟病調(diào)查工作組橫斷面問卷調(diào)查結(jié)果顯示：1.5%的中國成人長期服用含馬兜鈴酸類中草藥。長期服用含馬兜鈴酸中草藥與慢性腎臟病發(fā)生獨(dú)立相關(guān)［2］。新近研究證實(shí)馬兜鈴酸亦是影響多瑙河流域巴爾干腎病的致病因素［3］。由于受影響的地域及人群廣泛，AAN已成為全球性的公共衛(wèi)生問題［4］。然而，目前仍缺乏有效治療AAN的藥物。

近端腎小管上皮細(xì)胞是馬兜鈴酸腎損傷的首要靶點(diǎn)，其功能的維持極度依賴于線粒體［5］。新近的研究發(fā)現(xiàn)β2腎上腺素受體激動劑福莫特羅可以通過過氧化物酶體增殖物活化受體γ共激活因子 -1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）信號通路增加線粒體生物合成，從而有助于缺血再灌注引起的急性腎損傷的恢復(fù)［6］。然而，福莫特羅能否基于其對PGC-1α信號通路的調(diào)節(jié)作用而對AAN發(fā)揮治療作用，目前尚無相關(guān)報道。本研究擬通過小鼠急性AAN模型探討福莫特羅對急性AAN的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 24只8周齡雄性C57BL/6小鼠，體重18～22g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（生產(chǎn)許可證：SCXK（粵）2013-0002）。每日12h照明，飼養(yǎng)溫度20℃～25℃，濕度50%～70%。自由攝水、飲食。

1.2 試劑 馬兜鈴酸I（AAI）及福莫特羅（formoterol）均購自Sigma-Aldrich公司；組織DNA提取試劑盒QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN公司）；引物序列（life technologies公司）；SYBR Green（Roche公司）。細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（COX-I）（abcam公司）；PGC-1α（Santa Cruze公司）；β-actin（Sigma公司）；二抗（CST公司）。

1.3 儀器 全自動生化分析儀（Roche）；石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)（Leica）；普通光學(xué)顯微鏡（Nikon）；熒光定量PCR儀（Life Tech）；全自動凝膠成像和化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)：ChemiDocTM MP Imaging System（Bio-Rad Laboratories）；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥方法 24只小鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為4組：正常對照組、正常+福莫特羅組、模型組、模型+福莫特羅組，每組6只。造模方法為腹腔注射 AAI 5mg/kg/d，持續(xù) 5d［7］。急性AAN的造模依據(jù)為突發(fā)的腎功能急劇下降。在本研究中我們采用血肌酐及尿素氮水平的顯著升高作為造模成功的指標(biāo)。根據(jù)前期研究基礎(chǔ)，我們采用該方法制備急性AAN模型的成功率在90%以上。福莫特羅給藥方法為造模前2天開始給藥，劑量為0.3mg/kg/d，共給藥7d。殺檢后留取血清及腎臟標(biāo)本。

2.2 尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）測定 采用全自動生化分析儀測定。

2.3 腎臟病理檢測 石蠟切片行PAS染色。腎臟病理損傷根據(jù)腎小管上皮細(xì)胞壞死、刷狀緣脫落、管型及小管擴(kuò)張的綜合比例進(jìn)行評分。0分=無以上改變；1分=以上改變＜10%；2分=以上改變11%-25%；3分=以上改變26%-45%；4分=以上改變46%-75%；5分=以上改變＞76%［8］。

2.4 PCR 按照QIAamp DNA Mini Kit試劑盒說明書要求提取腎臟皮質(zhì)總DNA。取2μL DNA樣品于NanoDrop 1000紫外分光光度計檢測260nm處吸光值，依據(jù)所測DNA濃度，設(shè)定一定體積V，換算后用DEPC水配成同一濃度備用。引物序 列 如 下：mtDNA forward 5＇-TTTTATCTGCATCT GAGTTTAATCCTGT-3＇ and reverse 5＇-CCACTTC ATCTTACCATTTATTATCGC-3＇；18S rRNA forward 5＇-GGACCTGGAACTGGCAACAT-3＇ and reverse 5＇-GCCCTGAACTCTTTTGTGAAG-3＇。反應(yīng)條件為：95℃ 10min→95℃ 15sec→60℃ 1min 循環(huán)40次。采用內(nèi)參DNA片段表達(dá)ΔCt法計算目的DNA片段的表達(dá)，反映mtDNA拷貝數(shù)的相對定量。

2.5 蛋白印記 提取各組小鼠腎臟皮質(zhì)蛋白并測濃度，將等量的蛋白加入上樣孔中依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉60min；孵育一抗、二抗，曝光顯影，圖像分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），并進(jìn)行兩兩比較。所有檢驗(yàn)應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠BUN、Scr水平比較 模型組小鼠BUN及Scr顯著升高（P＜0.01）。經(jīng)福莫特羅治療后AAN小鼠BUN及Scr均有一定程度的下降（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見圖1。以上結(jié)果提示急性AAN造模成功；福莫特羅可顯著改善AAN小鼠腎功能。

圖1 各組小鼠BUN（A）及Scr（B）水平

3.2 腎臟病理改變 由圖2（A）可見，模型組小鼠腎臟病理表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞壞死、脫落，刷狀緣丟失，管型及腎小管擴(kuò)張。福莫特羅治療組以上損傷均有所恢復(fù)。腎臟病理評分與PAS染色相符（圖2B）。以上結(jié)果提示福莫特羅可顯著改善AAN小鼠腎臟病理損傷。

圖2 各組小鼠腎臟病理改變（A）及評分（B）

3.3 線粒體生物合成 由圖3（A）所示，模型組小鼠腎臟線粒體DNA拷貝數(shù)顯著下降（P＜0.01），而福莫特羅治療組則有所恢復(fù)（P＜0.05）。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠腎臟PGC-1α及COX-I表達(dá)顯著下調(diào)，而經(jīng)福莫特羅治療后可顯著恢復(fù)其表達(dá)（P＜0.01）（圖3B-D）。以上結(jié)果提示AAN小鼠腎臟線粒體數(shù)量下降，可能與PGC-1α信號通路有關(guān)。

圖3 各組小鼠線粒體生物合成改變

4 討論

本研究采用AAI誘導(dǎo)C57BL/6小鼠發(fā)生急性AAN，并探討福莫特羅的干預(yù)作用及可能機(jī)制。結(jié)果表明，AAI 5 mg/kg/d持續(xù)腹腔注射5天可以引起急性AAN，表現(xiàn)為BUN及Scr的顯著升高及腎臟病理損傷。AAN小鼠腎臟線粒體數(shù)量下降，線粒體合成的關(guān)鍵蛋白表達(dá)下調(diào)。福莫特羅治療可顯著改善AAN小鼠的腎功能及病理損傷，并可上調(diào)線粒體生物合成。

福莫特羅是一種長效的特異性β2腎上腺素受體激動劑。最近的研究發(fā)現(xiàn)，福莫特羅可以增加小鼠骨骼肌細(xì)胞中PGC-1α mRNA的表達(dá)。而且，鍛煉誘導(dǎo)的PGC-1α mRNA增加可以被預(yù)處理β2腎上腺素受體拮抗劑所抑制，提示β2腎上腺素受體激活介導(dǎo)了鍛煉誘導(dǎo)的骨骼肌PGC-1α表達(dá)的增加［9］。由于PGC-1α是線粒體生物合成的關(guān)鍵蛋白，因此福莫特羅可以增加線粒體生物合成［10-11］。本研究中AAN小鼠腎臟線粒體PGC-1α及線粒體生物合成均顯著下調(diào)，而福莫特羅治療后可上調(diào)PGC-1α、增加線粒體呼吸復(fù)合體亞基的表達(dá)及線粒體DNA拷貝數(shù)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Jesinkey等的研究相一致，其研究表明福莫特羅可以通過PGC-1α-線粒體生物合成改善缺血再灌注引起的小鼠急性腎損傷［6］。

綜上所述，本研究結(jié)果提示福莫特羅可以有效改善AAI誘導(dǎo)的急性AAN，其機(jī)制可能與促進(jìn)線粒體生物合成有關(guān)。該研究提示針對PGC-1α信號通路調(diào)節(jié)線粒體生物合成可作為AAN的治療靶點(diǎn)。

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