非創(chuàng)傷性股骨頭壞死與潛在關(guān)鍵基因表達(dá)譜的相關(guān)研究

晏濤， 郜玉忠

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨關(guān)節(jié)病區(qū)，遼寧錦州121001）

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（non-traumatic osteonecrosis of femoral head，NOFH）是一種進(jìn)行性病理過程，由于股骨頭供血受阻、局部循環(huán)中斷和軟骨下骨供血受損導(dǎo)致骨壞死和塌陷，最終致髖關(guān)節(jié)功能受損和永久性殘疾［1-2］；早期癥狀不明顯，患者總是錯過最佳的治療時機［3］.此外，Weinstein［4］認(rèn)為股骨頭壞死不能逆轉(zhuǎn)，早期診斷和治療干預(yù)非常重要.非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的病因和發(fā)病機制尚不清楚，缺乏預(yù)防和早期診斷治療股骨頭壞死的有效方法.

股骨頭壞死病因?qū)W機制假說眾多，脂類代謝紊亂、凝血循環(huán)障礙、髓內(nèi)高壓、細(xì)胞功能障礙學(xué)說等，有研究表明，基因多態(tài)性與股骨頭壞死有關(guān)，Lin等［5］最新研究發(fā)現(xiàn)與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)相關(guān)的Fcer1A和Il7R基因和與肌肉系統(tǒng)過程相關(guān)的Tnn2、Mylpf和Myl1基因可能與類固醇誘導(dǎo)的股骨頭壞死機制相關(guān).甲狀旁腺激素受體1（parathyroid hormone receptor 1，PTHR1）可能通過與維生素D受體（vitam in D receptor，VDR）相互作用而參與糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的股骨頭缺血壞死［6］.信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducers and activators of transcription1，STAT1）-蛋白酶 3途徑在類固醇誘發(fā)的股骨頭壞死病程中通過上調(diào)蛋白酶3的表達(dá)和STAT1的激活發(fā)揮關(guān)鍵作用，并促使股骨頭壞死［7］.

本研究根據(jù)Liu等［8］公開發(fā)表的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的生物信息學(xué)分析.篩選非創(chuàng)傷性股骨頭壞死和健康對照組織之間的差異表達(dá)基因，并對基因功能、信號通路及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，可能有助了解非創(chuàng)傷性股骨頭壞死發(fā)病的分子機制及生物學(xué)信息.

1 材料與方法

1.1 材料

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的基因芯片數(shù)據(jù)GSE74089（Liu等，2016）從公共數(shù)據(jù)庫GEO下載（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）.以 necrosis of femoral head為數(shù)據(jù)檢索關(guān)鍵詞，研究類型為Expression profiling by array，限制種屬為 Homo sapiens，是1個基于Agilent-026652全基因組微陣列4x44K v2的芯片平臺：GPL13497.此芯片共包含有8例股骨頭髖關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本.

1.2 數(shù)據(jù)的提取、處理及差異基因分析

基因表達(dá)譜的原始數(shù)據(jù)集利用Perl（practical extraction and report language）工具優(yōu)先基因ID轉(zhuǎn)換后，提取基因矩陣相關(guān)數(shù)據(jù).將整理后的數(shù)據(jù)用R語 言 的 limma包 （http：//bioconductor.org/biocLite.R）分析，嚴(yán)格按照RMA算法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化及表達(dá)值計算，最終篩選出股骨頭壞死組與健康對照組之間差異表達(dá)基因，并繪制火山圖.差異表達(dá)基因需同時滿足以下篩選條件：（1）采用t檢驗，定義校正后P＜0.05；表示差異倍數(shù)（fold change）.

1.3 差異表達(dá)基因的富集分析

DAVID（database for annotation，visualization and integrated discovery）是在線生物信息學(xué)分析工具（https：//david.ncifcrf.gov/），擁有一系列功能注釋工具，可為大規(guī)模的基因進(jìn)行生物功能富集分析.通過上傳差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）功能注釋分析.用 R語言的GOplot包進(jìn)行差異基因功能可視化繪圖.設(shè)定P＜0.05和FDR＜0.05為顯著性基因富集的臨界值.用R語言的RSQLite、cluster Profiler包進(jìn)行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路的富集分析.應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)檢驗，設(shè)置條件：P＜0.005，找出與整個基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著性富集的通路.

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

STRING（search tool for the retrieval of interacting genes/proteins，https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫是利用已知或預(yù)測的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)組成的網(wǎng)絡(luò)資源，包括直接和間接的蛋白質(zhì)相互作用.通過STRING對壞死股骨頭軟骨差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，核心蛋白是PPI網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)作用的重要節(jié)點，為少數(shù)具有許多相互作用的中樞蛋白.設(shè)置條件：combined score＞0.9.用Cytoscape軟件可視化PPI網(wǎng)絡(luò)圖.將互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)用R語言barplot包繪圖，顯示前20個互作網(wǎng)絡(luò)中突出的中心節(jié)點蛋白并進(jìn)一步GO功能富集分析.

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

依據(jù)差異表達(dá)基因篩選條件，與健康對照組對比，股骨頭壞死組共獲得1 315個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因809個，下調(diào)基因506個（圖1）.數(shù)據(jù)結(jié)果表明，用差異表達(dá)基因可以將股骨頭壞死組從健康對照組中區(qū)分開來.

2.2 差異表達(dá)基因GO分析結(jié)果

通過GO功能富集分析，809個上調(diào)基因中有14個基因富集呈顯著性（P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05），506個下調(diào)基因中有12個基因富集呈顯著性（P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05）.結(jié)果顯示，上調(diào)的差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞外基質(zhì)、膠原纖維組織、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)、膠原蛋白三聚體、膠原分解代謝過程、細(xì)胞外基質(zhì)組織、胞外空間、泛素-蛋白轉(zhuǎn)移酶活性（FBXW7、HACE1）、蛋白結(jié)合（FBXW7、HACE1）等功能類別；下調(diào)的差異表達(dá)基因主要涉及通過 MHCⅡ類抗原加工和呈遞肽或多糖抗原、MHCⅡ類蛋白復(fù)合物、MHCⅡ類受體活性、免疫球蛋白產(chǎn)生涉及免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)的組成、干擾素-γ介導(dǎo)的信號通路、抗原加工和表現(xiàn)、通過MHCⅡ類抗原處理和呈遞外源肽抗原等功能類別（表 1）.采用DAVID進(jìn)一步對股骨頭壞死樣本的全部1315個差異基因行GO功能富集分析顯示，6個GO功能富集顯著相關(guān)，主要涉及蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)（proteinaceous extracellular matrix）、胞外空間（extracellular space）、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）、膠原蛋白三聚體（collagen trimer）、細(xì)胞外基質(zhì)組織（extracellular matrix organization）、膠原纖維組織（collagen fibril organization）.從6類GO功能富集中選取顯著表達(dá)的40個差異基因，用R語言GOplot包繪制基因聚類分布情況（圖2）.

圖1 差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Volcano plot of differentially expressed genes

表1 上、下調(diào)差異表達(dá)基因前12個GO功能分析結(jié)果Table 1 The top 12 enriched GO terms of the UP-and down-regulated differentially expressed genes

BP（biological process，生物學(xué)過程）；CC（cellular component，細(xì)胞組分）；MP（molecular function，分子功能）；GO（gene ontology，基因本體論）.

圖2 差異表達(dá)基因的前6個GO功能富集和弦圖（top40）Fig.2 The top 6 enriched GO terms of the 40 differentially distinctly expressed genes are enriched in the chord plot

2.3 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

為了解差異基因參與的代謝通路及具體的生物學(xué)功能，進(jìn)行KEGG通路分析.結(jié)果顯示上調(diào)差異表達(dá)基因主要富集了黏著斑（VEGFC）、蛋白質(zhì)消化吸收、松弛素信號通路、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、Hippo信號通路、凋亡信號通路（如SGK1）、癌癥途徑、Hedgehog信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路等；而下調(diào)的差異表達(dá)基因主要富集途徑如抗原加工和表現(xiàn)（HLA-DRB4）、同種異體移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主病、造血細(xì)胞譜系、細(xì)胞粘附分子（CAMs）、HLA-DRB4、Th1/Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)等（表2）.

表2 差異表達(dá)基因的KEGG通路分析Table 2 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes

2.4 差異表達(dá)基因PPI分析

為闡釋涉及股骨頭壞死差異基因分子機制，通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，用cytoscape軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖.PPI網(wǎng)絡(luò)由391個節(jié)點和1 213個交互組成（圖3）.紅色、綠色節(jié)點分別表示股骨頭壞死樣本相較于健康對照組高、低表達(dá)的基因.蛋白互作網(wǎng)絡(luò)交互密集的20個中心節(jié)點蛋白依次為：GNB5、GNG12、GNG13、GNG8、BTRC、ADCY7、BDKRB1、SAA1、UBE2N、SOCS3、UBE2B、DET1、FBXL4、FBXO32、FBXW7、GCGR、HACE1、HERC1、KBTBD13、KLHL2（圖4）.根據(jù)GO富集分析，這些差異表達(dá)基因主要參與蛋白質(zhì)泛素化（HACE1、FBXW7），異三聚體G蛋白復(fù)合物（GNG8）和泛素-蛋白轉(zhuǎn)移酶活性（HACE1、FBXW7）（表3）.

圖3 上、下調(diào)差異基因構(gòu)建的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Protein-protein interaction network constructed with the up-and down-regulated differentially expressed genes

3 討論

隨著新一代高通量基因芯片技術(shù)的發(fā)展，生物信息學(xué)正在改變?nèi)藗冄芯可镝t(yī)學(xué)的傳統(tǒng)方式，高通量測序技術(shù)以及數(shù)據(jù)分析技術(shù)已成為探索生物學(xué)底層機制和研究人類復(fù)雜疾病診斷、治療及預(yù)后的重要工具.本研究主要通過生物信息學(xué)技術(shù)對GEO數(shù)據(jù)庫下載的非創(chuàng)傷性股骨頭壞死基因芯片（GSE74089）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并使用R語言包挖掘數(shù)據(jù)，探索可作為股骨頭壞死診斷、發(fā)病機制的潛在關(guān)鍵基因，是NOFH中基于人關(guān)節(jié)軟骨的第一個基因表達(dá)譜生物信息學(xué)研究，本研究結(jié)果可能為NOFH的發(fā)病機制及治療措施提供新的選擇依據(jù).

在本研究中，共獲得809個上調(diào)差異表達(dá)基因和506個下調(diào)差異表達(dá)基因.根據(jù)GO顯著富集結(jié)果分析，差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞外基質(zhì)、胞外空間、膠原蛋白三聚體、膠原纖維組織等.這些顯著富集的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因和膠原基因均為上調(diào)基因，有研究表明此類基因的突變可能與關(guān)節(jié)炎及股骨頭的壞死發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［8］.圖2中COL5A1編碼V型膠原的α鏈?zhǔn)墙Y(jié)締組織的次要組分.在動物研究中，發(fā)現(xiàn)COL5A1的功能障礙產(chǎn)生異常關(guān)節(jié)表型，如關(guān)節(jié)松弛和早發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎［9］.ASPN編碼軟骨細(xì)胞外蛋白質(zhì)，能夠通過阻斷軟骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β受體相互作用來負(fù)調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的軟骨形成［10］.OGN編碼骨膠原能夠誘導(dǎo)異位骨形成和調(diào)節(jié)心血管發(fā)育［11-12］.CRTAC1編碼軟骨酸性蛋白1在關(guān)節(jié)軟骨的深部區(qū)域表達(dá).CRTAC1作為區(qū)分軟骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的生物標(biāo)志物［13］.

KEGG通路分析中，黏著斑（focal adhesion）是細(xì)胞骨架中的一種重要的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞依靠“黏著斑”特殊結(jié)構(gòu)來保持其正常形態(tài)和發(fā)揮其正常功能［14］.黏著斑可能參與骨壞死早期時調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的過程.蛋白質(zhì)消化吸收（protein digestion and absorption）與股骨頭缺血壞死后期骨質(zhì)平衡破壞、關(guān)節(jié)軟骨塌陷有關(guān).松弛素信號通路（relaxin signaling pathway）具有多效性作用，包括血管擴張，抗纖維化和血管生成作用［15］.與股骨頭壞死患者微血管病變、血液循環(huán)障礙、凝血機制異常密切相關(guān).轉(zhuǎn)化生長因子 β信號通路（TGF-beta signaling pathway）中的轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）家族成員，包括TGF-β，激活素和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP），廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，凋亡，分化和遷移功能［16］.大量研究證實BMP有誘導(dǎo)成骨作用，其中BMP-2成骨誘導(dǎo)作用最強，是最有前途的骨誘導(dǎo)物質(zhì)［17］.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis）系慢性自身免疫性關(guān)節(jié)疾病，本身就可以進(jìn)展為股骨頭壞死，如有激素或類固醇的誘導(dǎo)，發(fā)生骨壞死的比率將明顯增加［18］.骨髓造血細(xì)胞為股骨頭骨組織的重要組成部分，造血細(xì)胞系（hematopoietic cell lineage）中骨髓造血細(xì)胞的病理改變可影響股骨頭壞死的發(fā)展.抗原加工和表現(xiàn)（antigen processing and presentation）、Th1和 Th2細(xì)胞分化（Th1 and Th2 cell differentiation）及 Th17細(xì)胞分化（Th17 cell differentiation）均涉及免疫系統(tǒng).Okazaki等［19］已經(jīng)證明股骨頭壞死與免疫系統(tǒng)的破壞有關(guān)，免疫失調(diào)可導(dǎo)致骨代謝異常，骨量減少及骨小梁塌陷，最終導(dǎo)致骨壞死.

從PPI網(wǎng)絡(luò)交互密集的20個中心節(jié)點蛋白進(jìn)行潛在關(guān)節(jié)基因挖掘，發(fā)現(xiàn)了HACE1、FBXW7、GNG8、SAA1前4名潛在基因.在本研究中，上調(diào)的HACE1、FBXW7主要涉及蛋白質(zhì)泛素化.HACE1是HECT家族E3連接酶，通過介導(dǎo)Rac1的泛素化，激活泛素 -蛋白酶體途徑［20］.HACE1生物學(xué)功能廣泛，可通過介導(dǎo)核因子E2相關(guān)因子2（NRF2）發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用.氧化應(yīng)激是缺血性損傷的重要病理機制，Ichiseki等［21］研究發(fā)現(xiàn)，短暫氧化應(yīng)激即可加重骨壞死.Murata等［22］研究證實，激素可能通過氧化應(yīng)激途徑產(chǎn)生骨壞死.有研究報道HACE1的喪失可增加體內(nèi)外活性氧（ROS）水平，HACE1的喪失導(dǎo)致ROS依賴性谷氨酰胺成癮［23］.活性氧（ROS）增加可促進(jìn)股骨頭壞死發(fā)生，而抗氧化劑的使用可在一定程度上抑制這一病理過程［24］.最近研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Rac1與Rac1依賴性NADPH氧化酶復(fù)合物結(jié)合時，HACE1特異性地靶向活化Rac1，以降低ROS產(chǎn)生［25］.FBXW7基因編碼的蛋白是F-box蛋白家族的一員.FBXW7可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮Notch信號途徑控制血管形成［26］.同時FBXW7是脂肪細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子，F(xiàn)BXW7的上調(diào)有助于脂肪細(xì)胞肥大相關(guān)的 G0/G1期細(xì)胞周期停滯［27］.Onoyama等［28］研究認(rèn)為FBXW7在調(diào)節(jié)肝臟的脂肪生成和細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用.目前沒有證據(jù)表明HACE1和FBXW7與股骨頭壞死的發(fā)病機制有關(guān).因此，推測HACE1和FBXW7可能通過蛋白質(zhì)泛素化過程參與股骨頭壞死的進(jìn)展.

此外，在 PPI網(wǎng)絡(luò)模塊中，下調(diào)的GNG8、SAA1分別涉及異三聚體G蛋白復(fù)合物與炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)過程.GNG8（鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白8）是細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移過程中一個極為重要的趨化因子.GNG8通過細(xì)胞膜G蛋白磷酸化和去磷酸化參與多細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［29］.G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）在內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，以及成血管細(xì)胞的遷移、分化等過程中發(fā)揮作用［30-31］.Li等［32］發(fā)現(xiàn) FIZZ1（炎癥區(qū)域分子 1）可以通過上調(diào)GNG8、ATG9A和P13K/Akt通路基因表達(dá)來提高大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力.目前，改善股骨頭及其周圍血液循環(huán)、促再血管化及促成骨是早期股骨頭壞死治療的研究熱點.SAA1（血清淀粉樣蛋白1）是一種新的促炎性脂肪細(xì)胞因子，也是一種炎癥信號的觸發(fā)劑.Wang等［33］研究發(fā)現(xiàn)SAA1是動脈粥樣硬化和心肌梗死的候選基因.最近幾項研究報道了SAA1基因多態(tài)性與頸動脈粥樣硬化癥［34］、脂質(zhì)水平［35］、尿酸水平［36］和外周動脈疾?。?7］的關(guān)系.Xu等［38］也報道SAA1基因多態(tài)性與脂質(zhì)水平相關(guān).SAA1基因多態(tài)性也與中國人群的骨質(zhì)疏松有關(guān)，與SAA基因多態(tài)性引起的脂質(zhì)紊亂有關(guān)［39］.本研究中，兩個基因富集于血管生成及脂質(zhì)代謝過程，GNG8、SAA1之間的相互作用可能在股骨頭壞死發(fā)展中起重要作用.

綜上，采用生物信息學(xué)的方法在股骨頭壞死樣品中共鑒定出809個上調(diào)與506個下調(diào)差異表達(dá)基因.HACE1、FBXW7、GNG8和SAA1等基因以及松弛素信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路等可能與非創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死的病理機制密切相關(guān).為股骨頭缺血壞死發(fā)病機制的研究與治療提供參考.

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