m iR-132在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的生物學(xué)功能

陳 清， 符方勇， 黃顯瑩， 萬 恒， 劉文俊， 劉正軍

（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血管外科，廣東廣州510515）

動脈粥樣硬化是由多種原因造成膽固醇等脂質(zhì)沉積于動脈內(nèi)膜下，纖維組織增生和鈣質(zhì)沉著、斑塊內(nèi)出血和血栓形成，最終致動脈管壁變硬、管腔狹窄甚至閉塞而引發(fā)一系列的缺血性癥狀，動脈壁中的慢性炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝異常、內(nèi)皮損傷動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中主要因素［1-3］.黃顯瑩等［4］在實驗中發(fā)現(xiàn)miR-132與脂代謝調(diào)控相關(guān)而脂代謝學(xué)說在動脈粥樣硬化形成中占據(jù)重要地位.本研究探討miR-132對內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及作用機(jī)制，為動脈粥樣硬化的基因靶向治療提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集南方醫(yī)院2011年1月至2015年12月手術(shù)切除的動脈粥樣硬化標(biāo)本48例，其中男30例，女18例，年齡40～80歲，平均60歲.實驗組為動脈粥樣硬化組織，對照組為正常動脈組織，并經(jīng)術(shù)后病理證實.獲得患者的知情同意，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員審核通過.

1.2 實驗材料及來源

內(nèi)皮細(xì)胞購買自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；miR-132-3p inhibitor、miR-Negative control（陰性對照）、內(nèi)參U6購買自廣州銳博生物科技公司，引物由上海生工生物合成，TRIzol、總RNA提取試劑盒、Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購自日本 Ta-KaRa公司.Caspase-GloH 3/7 Assay Systems購買自Promega公司.Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購買自日本同仁公司；Annexin VFITC Apoptosis Detection試劑盒購買自BD公司；一抗anti-PCNA，KLF5，caspase-3，Bax，GAPDH，βactin購置Santa Cruz生物科技公司.

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).選取對數(shù)期生長的細(xì)胞接種于6孔板上，待細(xì)胞融合度為75%左右時參照說明書用Lipo2000轉(zhuǎn)染.miR-132 inhibitor轉(zhuǎn)染實驗分3組：空白對照組（Blank）、陰性對照組 miR-NC（miR-NC）、轉(zhuǎn)染miR-132 inhibitor組.轉(zhuǎn)染后24 h后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光，檢測轉(zhuǎn)染效率.

1.4 Real-time PCR檢測動脈粥樣硬化標(biāo)本組織及正常動脈組mRNA表達(dá)水平

TRIzol法提取組織或細(xì)胞的總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：37℃15 min，85℃5 s.擴(kuò)增體系采用SYBR Premix Ex Taq 10μL，上、下游引物各 0.5μL，提取的模板DNA 1μL，加去核酶水至20μL.擴(kuò)增的條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s、65℃ 30 s，40次循環(huán).采用2-ΔΔCt法計算 miR-132的相對表達(dá)水平.U6的反轉(zhuǎn)錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAAAATATGGAAC-3′，miRNA的定量PCR引物上下游引物分別為：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′和5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′.

1.5 CC-8法檢測轉(zhuǎn)染后內(nèi)皮細(xì)胞增殖水平的改變

將轉(zhuǎn)染后24 h的細(xì)胞，消化后收集細(xì)胞，按2.00×103個每孔接種到96孔板，每孔加入100μL單細(xì)胞懸液，各組設(shè)5個復(fù)孔.于種板后1～5 d進(jìn)行檢測，待細(xì)胞貼壁后，用CCK8分別測定1～5 d時細(xì)胞的增殖活性.檢測前2 h，加入10μL/孔CCK8溶液，37℃孵育2 h，利用酶標(biāo)儀上測定450 nm波長處各孔的吸光度值A(chǔ).

1.6 流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期、凋亡情況

將轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液并體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇固定，RNase A（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 mg/mL）200μL，37℃孵育30min，與800μL碘化丙啶染色液混勻后，4℃避光染色30 min，使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期.收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞沉淀1次，收集細(xì)胞沉淀；1 mL染色緩沖液重懸細(xì)胞；取100μL重懸細(xì)胞液加入5μL Annexin V-APC染色，室溫避光15 min后上機(jī)檢測凋亡水平.

1.7 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后內(nèi)皮細(xì)胞中增殖、凋亡、脂代謝相關(guān)基因的蛋白的表達(dá)水平

收集轉(zhuǎn)染后的內(nèi)皮細(xì)胞，加入提取緩沖液并收集其裂解液，BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度調(diào)節(jié)上樣量，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%濃度的SDSPAGE膠電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，按分子量大小剪下相應(yīng)大小的PVDF膜在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉封閉液中行抗原封閉，加入一抗孵育，洗膜后孵育二抗后進(jìn)行顯影、定影.

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析.實驗均重復(fù)3次，計量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，組織分析采用兩獨立樣本的t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗.P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR檢測動脈粥樣硬化及正常動脈組織中的m iR-132-3p的表達(dá)

結(jié)果顯示與正常動脈組織相比較，動脈粥樣硬化組織中miR-132-3p的表達(dá)明顯降低（t＝15.47，P＜0.000 1，圖 1）.

圖1 Real-time PCR檢測動脈粥樣硬化及正常動脈組織中miR-132的表達(dá)水平Fig.1 Detection of miR-132 expression in abmormal and normal arterial tissue by real-time PCR

2.2 Real time PCR檢測內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染后m iR-132-3p的表達(dá)水平

Real time PCR檢測結(jié)果顯示miR-132-3p inhibitor組為（1.424±0.09）、miR-NC組為（0.90±0.15），Blank組為（1.12±0.12），與 Blank和 miRNC組比較，miR-132 inhibitor組細(xì)胞miR-132-3p表達(dá)水平降低，有統(tǒng)計學(xué)差異（F＝81.83，P＜0.000 1，圖 2），表明轉(zhuǎn)染成功.

圖2 miR-132-3p inhibitor轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞后miR-132-3p表達(dá)水平Fig.2 Detection of miR-132 expression in endothelial cells after transfected with miR-132-3p inhibitor

2.3 CCK8法檢測轉(zhuǎn)染后的內(nèi)皮細(xì)胞增殖水平

與Blank及miR-NC組比較，從第3天開始miR-132 inhibitor組內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力較Blank與 miR-NC組明顯增強(qiáng)（P＜0.001，圖 3），Blank與miR-NC組相比較，無統(tǒng)計學(xué)差異.

2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡的變化

Blank、miR-NC、miR-132 inhibitor組分別為（6.21±1.36）%、（15.34±1.68）%、（28.38±2.74）%.miR-132 inhibitor組較 Blank及 miR-NC組細(xì)胞凋亡率明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)差異（圖4）.

圖4 miR-132對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effects ofmiR-132 on apoptosis of human umbical vein endothelial cells

2.5 m iR-132-3p抑制增殖相關(guān)基因 PCNA和KLF5的表達(dá)

為進(jìn)一步明確機(jī)制miR-132-3p抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖分子機(jī)制，Western blot實驗檢測人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)增值細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和轉(zhuǎn)錄因子 5（kruppel-like factors，KLF5）表達(dá)及活性，相較于NC組，轉(zhuǎn)染inhibitor，細(xì)胞PCNA和KLF5表達(dá)升高（圖5）.提示miR-132-3p抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖分子機(jī)制可能與PCNA和KLF5的表達(dá)有關(guān)，miR-132-3p可能通過激活PCNA和KLF5依賴性增殖機(jī)制抑制HUVEC增殖.

2.6 miR-132-3p促進(jìn)凋亡相關(guān)基因caspase-3和Bax的表達(dá)

為進(jìn)一步明確機(jī)制miR-132-3p促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡分子機(jī)制，Western blot檢測人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因胱天蛋白酶Caspase-3和凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)及活性，相較于NC組，轉(zhuǎn)染inhibitor，細(xì)胞Caspase-3和 Bax表達(dá)下調(diào)（圖6）.提示miR-132-3p促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡分子機(jī)制可能與Caspase-3和Bax的表達(dá)有關(guān)，miR-132-3p可能通過激活Caspase依賴性凋亡機(jī)制誘導(dǎo)HUVEC死亡.

圖5 miR-132抑制增殖相關(guān)基因PCNA和KLF5的表達(dá)Fig.5 miR-132 inhibits the expression of PCNA and KLF5 proliferation related genes

圖6 miR-132促進(jìn)凋亡相關(guān)基因Caspase-3和Bax的表達(dá)Fig.6 miR-132 promotes expression of Caspase-3 and Bax apoptosis related gene

3 討論

研究表明，動脈粥樣硬化是血管壁長期過度炎癥刺激引起的結(jié)果，其通常以內(nèi)皮中的炎性變化開始［5-6］.基因水平的治療是動脈粥樣硬化研究中的熱點，且急需尋求有效的基因治療靶點.目前研究表明miRNA具有廣泛的基因調(diào)節(jié)功能，參與一系列的生物學(xué)進(jìn)程，如胚胎的發(fā)育、細(xì)胞增殖與凋亡和造血功能等.有學(xué)者研究動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展時發(fā)現(xiàn)，miRNA常表達(dá)失調(diào)，惡性生物學(xué)表型和某些miRNA有著密切的關(guān)系［7-8］.miR-132在動脈粥樣硬化形成中占據(jù)重要地位［9-10］.

本研究小組前期研究顯示miR-132-3p能夠抑制 SIRT1，SREBP-1c及其下游基因表達(dá)，而SREBP-1c控制并參與脂肪酸、脂質(zhì)和膽固醇生物合成相關(guān)基因［11-13］，在本研究中，miR-132-3p能夠抑制HUVEC中脂肪酸和膽固醇的生成，表明miR-132-3p能夠通過抑制SIRT1和SREBP-1c表達(dá)和下調(diào)其靶向基因包括FASN和HMGCR可抑制HUVEC中的脂質(zhì)生成和膽固醇生成.miRNA影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，參與血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖并在動脈粥樣硬化的形成過程中，血管壁細(xì)胞，如EC和VSMC的變化發(fā)揮了重要作用.內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙增加內(nèi)皮層的通透性和相應(yīng)細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)，減少內(nèi)皮層的再生.VSMC的遷移及增值則促進(jìn)粥樣斑塊的形成，加速冠狀動脈粥樣硬化的進(jìn)程.而內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌的功能障礙及遷移、增殖均可受miRNA的調(diào)控［14］.

本研究結(jié)果顯示動脈粥樣硬化組織中miR-132-3p的表達(dá)水平較正常組織明顯降低，將miR-132-3p inhibitor轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮細(xì)胞中，使miR-132-3p表達(dá)水平受抑制，CCK8實驗提示下調(diào)miR-132-3p的表達(dá)能明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力.流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡結(jié)果提示抑制miR-132-3p的表達(dá)水平，G0/G1期的細(xì)胞數(shù)明顯增加，表明miR-132表達(dá)下降可以影響內(nèi)皮細(xì)胞周期，而同時細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多，凋亡率增高.

另外，下調(diào)miR-132-3p表達(dá)水平后內(nèi)皮細(xì)胞增殖受抑制并促進(jìn)其凋亡；PCNA與Klfs是一類與增殖相關(guān)的基因，PNCA表達(dá)水平和細(xì)胞增殖的結(jié)果相關(guān)，其表達(dá)水平的改變與細(xì)胞增殖情況相符［15］.當(dāng)細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)時，PCNA表達(dá)水平低，當(dāng)細(xì)胞處于增殖狀態(tài)時，PCNA表達(dá)水平迅速升高.因此.PCNA的表達(dá)水平高低能夠作為細(xì)胞評價細(xì)胞增殖狀態(tài)指標(biāo)［16］.KLFs是與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的一類轉(zhuǎn)錄因子，參與到早期血管形成，癌癥發(fā)生等一系列生理過程［17］.KLF5是KLF基因家族成員，KLF5在增殖狀態(tài)下檢測表達(dá)水平升高明顯［18］miR-132-3p通過抑制PCNA和KLF5表達(dá)，實現(xiàn)抑制細(xì)胞增值.因此，miR-132-3p能抑制HUVEC中的細(xì)胞增殖，存活力和遷移，并且也能誘導(dǎo)HUVEC的凋亡.

綜上，miR-132-3p能夠抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中脂質(zhì)和膽固醇的生成；miR-132-3p能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡推測miR-132-3p能夠抑制HUVEC細(xì)胞的增殖，并在體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，miR-132-3p通過調(diào)控相關(guān)基因的翻譯調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖及其凋亡水平，表明miR-132-3p可能在動脈粥樣硬化中作為一種促使基因，可作為治療動脈粥樣硬化的新靶點.

［1］CERSOSIMO E，DEFRONZO R A.Insulin resistance and endothelial dysfunction：the road map to cardiovascular diseases［J］.Diabetes Metab Res Rev，2006，22（6）：423-436.

［2］LEINNOEN M，SOIKLSU P.Infection and atherosclerosis［J］.Scand Cardiovasc J，2002，34（2）：12-20.

［3］OONI K，ALA-KORPEL M.Modified LDL-trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima［J］.J Inter Med，2000，247：359-370.

［4］黃顯瑩，符方勇，陳清，等.miR-132誘導(dǎo)動脈粥樣硬化中血管內(nèi)皮細(xì)胞的促炎性作用.miR-132 induces the pro-inflammatory of vascular endothelial cells in atherosclerosis［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（5）：20-22.

［5］MOORE K，TABAS I.Macrophages in the Pathogenesis of atherosclerosis［J］.Cell，2011，145（3）：341-355.

［6］劉俊田.動脈粥樣硬化發(fā)病的炎癥機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2015，36（2）：141-152.

［7］RAITOHARJU E，LYYTIK?INEN L P，LEVULA M，et al.miR-21，miR-210，miR-34a，and miR-146a/b are up-regulated in human atherosclerotic plaques in the tampere vascular study［J］.Atherosclerosis，2011，219（1）：211-217.

［8］VICKERS K C， REMALEY A T. MicroRNAs in atherosclerosis and lipoprotein metabolism.［J］.Current Opinion in Endocrinology Diabetes＆Obesity，2010，17（2）：150.

［9］ZHANG L，HUANG D，WANG Q，et al.MiR-132 inhibits expression of SIRT1 and induces pro-inflammatory processes of vascular endothelial inflammation through blockade of the SREBP-1c metabolic pathway［J］.Cardiovascular Drugs＆Therapy，2014，28（4）：303.

［10］CHOE N，KWON J S，KIM JR，et al.The microRNA miR-132 targets Lrrfip1 to block vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia［J］.Atherosclerosis，2013，229（2）：348-355.

［11］COZZONE D，DEBARD C，Dif N，et al.Activation of liver X receptors promotes lipid accumulation but does not alter insulin action in human skeletal muscle cells［J］.Diabetologia，2006，49（5）：990-999.

［12］CALKIN A C，TONTONOZP.Transcriptional integration of metabolism by the nuclear sterol-activated receptors LXR and FXR［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13（4）：213-224.

［13］IVASHCHENKO C Y，Bradley B T，AO Z H，et al.Regulation of the ADMA-DDAH system in endothelial cells：a novelmechanism for the sterol response element binding proteins，SREBP1c and-2［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，298（2）：H251-258.

［14］SCHOBER A，SCHOBER A，NAZARIJAHANTIGH M，et al.MicroRNA-126-5p promotes endothelial proliferation and limits atherosclerosis by suppressing Dlk1［J］.Nature Medicine，2014，20（4）：368-376.

［15］LIJ J，HANM，WEN JK，et al.Osteopontin stimulates vascular smooth muscle cell migration by inducing FAK phosphorylation and ILK dephosphorylation［J］.Biochemical＆ Biophysical Research Communications，2007，356（1）：13.

［16］MAFFIA P， GRASSIA G， MEGLIO P D， et al.Neutralization of Interleukin-18 inhibits neointimal formation in a rat model of vascular injury［J］.Circulation，2006，114（5）：430-437.

［17］ZHANG X H，ZHENG B，HAN M，et al.Synthetic retinoid Am80 inhibits interaction of KLF5 with RARα through inducing KLF5 dephosphorylation mediated by the PI3K/Akt signaling in vascular smooth muscle cells［J］.Febs Letters，2009，583（8）：1231-1236.

［18］GAO D， NIU X， NING N， et al. Regulation of angiotensin II-induced Krüppel-like factor 5 expression in vascular smooth muscle cells［J］. Biological＆Pharmaceutical Bulletin，2006，29（10）：2004-2008.