一起規(guī)模豬場胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

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(浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 310018)

胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)是豬胸膜肺炎的病原菌，為一種革蘭氏陰性、有莢膜、具有典型球桿菌形態(tài)的小桿菌。根據(jù)是否需要NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)，將其分為生物I型(依賴于NAD)和生物II型(不依賴于NAD)。生物I型在葡萄球菌菌落周圍形成菌落呈“衛(wèi)星”狀，培養(yǎng)24 h后形成0.5～1 mm菌落，用綿羊血制成的血平板上出現(xiàn)β溶血現(xiàn)象。臨床上引發(fā)豬放線桿菌胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumia，PCP)的主要是生物I型，該型細(xì)菌有13個(gè)血清型(1～12，15)[1-2]。1987年楊旭夫等首次證實(shí)了我國存在豬傳染性胸膜肺炎，其后幾年該病在我國的發(fā)病率顯著上升，并在我國許多地區(qū)呈流行趨勢，對集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了很大的威脅[3-5]。本次實(shí)驗(yàn)對浙江省杭州市蕭山區(qū)某規(guī)模豬場發(fā)病豬舍的4頭保育豬病料樣品進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，并對分離株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，為該豬場有效防控豬病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器設(shè)備 TissueLyserⅡ組織勻漿機(jī)、Thermo LH11 CO2培養(yǎng)箱、蔡司(ZEISS)Scope.A1顯微鏡、Thermo 1300 SERIES A2生物安全柜、Eppendorf移液器、Eppendorf恒溫混勻儀、Eppendorf 5424離心機(jī)、羅氏LightCycler?480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光PCR儀。

1.1.2培養(yǎng)基和試劑 血瓊脂平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)和革蘭氏染色液試劑盒購自青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌、胸膜肺炎放線桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；Ex Taq酶購自TaKaRa；QIAamp?DNA純化試劑盒-Mini購自QIAGEN；引物和探針由上海生工公司合成。

1.1.3樣本來源 2017年12月13日，采集浙江省杭州市蕭山區(qū)某規(guī)模豬場4頭發(fā)病保育豬的肺臟，分別編號為肺1、肺2、肺3、肺4。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌分離 無菌操作法切開病變組織，用接種環(huán)刮取病料接種于血平板，再用金黃色葡萄球菌作交叉劃線，于37℃、含5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.2細(xì)菌鑒定 于血平板上培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)。挑取可疑菌落作革蘭氏染色，油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)及染色情況。

1.2.3V因子需要測定 將可疑菌株純培養(yǎng)物接種于血平板，方法同1.2.1。

1.2.4過氧化氫酶試驗(yàn) 在潔凈的載玻片上滴1滴3%的H2O2溶液，用接種環(huán)挑取適量的可疑菌在H2O2溶液中混勻，觀察是否有氣泡產(chǎn)生。

1.2.5熒光定量PCR檢測 根據(jù)Tobias TJ等[6]的方法，合成一對特異性引物及探針。上游：GGG GAC GTA ACT CGG TGA TT，下游：GCT CAC CAA CGT TTG CTC AT，探針：CGG TGC GGA CAC CTA TAT CT。用DNA純化試劑盒提取待檢胸膜肺炎放線桿菌可疑菌株和胸膜肺炎放線桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸分別作為定量PCR的模板和陽性對照。擴(kuò)增體系：Taq酶0.12 μL，dNTPs 2 μL，上下游引物各0.2 μL，探針0.2 μL，10×buffer 2 μL，ddH2O 10.28 μL，DNA模板5 μL。按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

1.2.6藥敏試驗(yàn) 按照NCCL推薦的K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法，選用臨床上常用藥物分別對分離純化的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。用無菌生理鹽水將待檢菌株制成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?，含菌量?×107～5×108，用滅菌棉簽拭子浸入細(xì)菌懸液中，在管壁擠去多余菌液，然后均勻涂布在90 mmTSA瓊脂平板上，室溫靜止3～5 min后，無菌操作將藥敏紙片均勻貼在上述TSA平板上，37℃ 5% CO2培養(yǎng)48 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，判斷待檢菌株對各種藥物的敏感性[7]。

2 結(jié)果

2.1細(xì)菌分離結(jié)果 肺4分離到胸膜肺炎放線桿菌可疑菌株，編號為ZJYK-01226，其他病料(肺1、肺2和肺3)未發(fā)現(xiàn)胸膜肺炎放線桿菌可疑菌落。

2.2細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果

2.2.1菌落形態(tài) 在血平板培養(yǎng)24 h后，菌落呈露珠樣小菌落，呈β溶血，菌落直徑0.5 mm～1 mm。靠近金黃色葡萄球菌菌苔的菌落較大，隨著與葡萄球菌生長線的距離增加而變小或不生長。

2.2.2細(xì)菌形態(tài) 涂片作革蘭氏染色后，鏡檢為革蘭氏陰性短小桿菌。

2.3V因子需要測定結(jié)果 可疑菌株(ZJYK-01226)在血平板上生長有“衛(wèi)星現(xiàn)象”，表明該菌株需要V因子(圖1)。

圖1 可疑菌株生長呈“衛(wèi)星現(xiàn)象”

2.4過氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果 ZJYK-01226菌株過氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果為陽性。

2.5熒光定量PCR檢測結(jié)果 對ZJYK-01226菌株進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果為胸膜肺炎放線桿菌陽性(表1、圖2)。

圖2 ZJYK-01226菌株熒光定量PCR檢測結(jié)果

表1 可疑菌株熒光定量PCR檢測結(jié)果

綜合分析ZJYK-01226菌株的菌落形態(tài)、生長特性、細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查情況和熒光定量PCR檢測結(jié)果，可以判定該菌株為胸膜肺炎放線桿菌。

2.6藥敏試驗(yàn)結(jié)果 ZJYK-01226菌株對頭孢噻肟、氟苯尼考、氨曲南、頭孢呋辛、頭孢哌酮等藥物敏感；對復(fù)方新諾明、鏈霉素等藥物中敏；對青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、替米考星耐藥(表2)。

表2 ZJYK-01226菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：S-敏感；I-中介；R-耐藥，不同藥物判定標(biāo)準(zhǔn)不同。

3 討論

胸膜肺炎放線桿菌雖分布廣泛，但且僅感染豬。感染病原主要存在于慢性肺損傷和扁桃體中，很少在鼻腔中分離到。豬群間的傳播主要通過引入攜帶病原的動物，傳播的主要途徑是豬與豬的直接接觸或通過短距離的飛沫傳播。在地方性傳染的畜群中，感染母豬可以通過垂直傳播把該病傳染給后代，傳染的概率可能取決于母豬鼻腔分泌物中的細(xì)菌含量和仔豬體內(nèi)的母源抗體水平。母源抗體可持續(xù)2周到2個(gè)月[1]。在初次分離胸膜肺炎放線桿菌時(shí)，盡量選擇病變的肺臟或扁桃體病料，這樣可以提高分離率。在初分離時(shí)利用該菌在血平板上的“衛(wèi)星現(xiàn)象”特點(diǎn)，選擇可疑菌落是該菌分離的關(guān)鍵步驟。

在 PCP的防控中，對沒有感染胸膜肺炎放線桿菌的畜群應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行生物安全措施，對畜群而言最大的危險(xiǎn)是引進(jìn)潛在的感染豬，應(yīng)該從沒有發(fā)生過胸膜肺炎放線桿菌的地區(qū)或血清型陰性的地區(qū)引進(jìn)畜種，新引進(jìn)的動物應(yīng)進(jìn)行隔離和血清學(xué)檢測。感染胸膜肺炎放線桿菌的豬場爆發(fā)胸膜肺炎時(shí)，首先應(yīng)通過治療控制感染動物的死亡率，繼而通過控制環(huán)境因素、實(shí)行全進(jìn)全出制度、較早的斷奶日齡(少于21 d)等措施，降低發(fā)病率，減少損失。

值得注意的是胸膜肺炎放線桿菌也是豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)的病原體之一[8]，該豬場存在PRRS、豬瘟、沙門氏菌、豬圓環(huán)病毒2型混合/繼發(fā)感染，而胸膜肺炎放線桿菌感染是導(dǎo)致育肥豬群發(fā)生急性呼吸道感染爆發(fā)的最常見原因?？股胤乐问强刂票ＳA段副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、胸膜肺炎放線桿菌等細(xì)菌繼發(fā)/混合感染的有效手段，也是防控育成階段豬傳染性胸膜肺炎的有效措施，是減少豬群死淘率的重要措施。由于胸膜肺炎放線桿菌較易產(chǎn)生耐藥性，且不同地區(qū)的APP分離株對藥物的敏感性存在一定的差異。本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果對該發(fā)病豬場選擇敏感藥物提供了依據(jù)。

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