副豬嗜血桿菌的分離鑒定及中藥單體抑菌作用

(福建光華農(nóng)牧科技開發(fā)有限公司，福建 福州 350000)

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)引起的豬多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎[1]。目前H.parasuis在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給規(guī)模化豬場的生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。副豬嗜血桿菌屬于巴士桿菌科，NAD依賴型、兼性厭氧性、革蘭氏陰性細(xì)小桿菌、非溶血性、V因子依賴性、形態(tài)多變、無芽孢，是一種條件性致病菌，廣泛存在于豬的呼吸道[2]。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病料 福建省福州市某豬場的病豬關(guān)節(jié)液病料。

1.1.2主要試劑及培養(yǎng)基 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基 (TSA)、新生牛血清、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸( NAD+)、二甲基亞砜(DMSO)、Premix Taq、DNAmarker、瓊脂糖、TAE緩沖液、14種中藥單體標(biāo)準(zhǔn)品等。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌的分離 在超潔凈工作臺(tái)中取出病料，點(diǎn)燃酒精棉球?qū)Σ×系谋砻孢M(jìn)行火焰滅菌，切開關(guān)節(jié)腔，用滅菌的接種棒深入關(guān)節(jié)腔內(nèi)采集關(guān)節(jié)液，劃線于事先配制的TSA培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)菌的純化H.parasuis在含有NAD+及新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上生長良好，培養(yǎng)24 h以后用接種棒挑選疑似H.parasuis的單菌落，在新的TSA平板上劃線純化，37℃培養(yǎng)。24 h以后再挑選長勢良好的疑似H.parasuis的單菌落，接種到5 mL的TSB液體培養(yǎng)基中，放入恒溫?fù)u床，37℃、190 rpm振蕩培養(yǎng)12 h后分裝保存，等待下一步的驗(yàn)證。

1.2.3細(xì)菌DNA的提取 取1 mL事先保存的細(xì)菌培養(yǎng)液于1.5 mL離心管中，10000 rpm離心5 min，棄去上清液，加入500 μL的ddH2O，100℃煮沸10 min。再放入冰塊中冰浴5 min，10000 rpm離心5 min，取上清液裝入新的EP管內(nèi)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4PCR鑒定 取疑似副豬嗜血桿菌菌液，作為PCR模板，在25 μL反應(yīng)體系中加入Premix Taq 12.5 μL，模板DNA 1 μL，引物1.5 μL(P1、P2、P3各0.5 μL)，ddH2O 10 μL，瞬時(shí)離心混勻。然后在PCR儀中運(yùn)行以下程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s；56℃退火45 s；72℃延伸50 s 35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。將PCR的產(chǎn)物點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠孔中，120 V、120 A電泳20 min后，置于凝膠成像儀中觀察，并做好記錄。

1.2.5各種中藥對H.parasuis的最小抑菌濃度(MIC)測定 用高壓滅菌的10 μL槍頭挑取長勢良好的單菌落，轉(zhuǎn)接至TSB液體培養(yǎng)基中，37℃、190 rpm振蕩過夜培養(yǎng)。利用紫外分光光度計(jì)測量菌液OD600處的吸光度。用TSB肉湯稀釋，將菌液的吸光度值調(diào)節(jié)0.5個(gè)麥?zhǔn)媳葷?。在使用前，再將菌液稀?0倍(菌液濃度為1×107CFU/mL)。在無菌條件下，向96孔板的第一列加入190 μL TSB液體培養(yǎng)基,其他各孔加入100 μL TSB液體培養(yǎng)基。然后往第一列中分別加入10 μL濃度為5120 μg/mL的藥品儲(chǔ)備液，使其終濃度為256 μg/mL。吹打混勻以后，從第一列吸取100 μL液體到第二列中，再次吹打混勻，這樣依次倍比稀釋至第10號孔，吹打混勻后棄去100 μL液體。第11和第12號孔暫不做處理。蓋上蓋子后放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)12 h和24 h時(shí)取出試管，在無菌條件下用接種環(huán)取一些菌液在TBA固體培養(yǎng)基上劃線，再放入恒溫箱中培養(yǎng)48 h。觀察細(xì)菌是否生長，以細(xì)菌不生長的最小濃度作為最小殺菌濃度。

2 結(jié)果

2.1細(xì)菌菌落形態(tài) 從臨床采集病料中分離到的H.parasuis菌株，經(jīng)過純化后的菌株在含有新生牛血清和NAD+的TSA瓊脂平板上呈現(xiàn)為光滑濕潤，透明或者灰白色、露珠或者針尖狀大小的菌落。如圖1所示。

圖1 副豬嗜血桿菌形態(tài)

2.2PCR鑒定結(jié)果 根據(jù)H.parasuis的16S rRNA基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，將分離到的疑似H.parasuis的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物的大小為1028 bp。結(jié)果證明所分離到菌株有4株為H.parasuis。

M：DL2000 DNAmarker；陽性：陽性對照；1、2、3、4：檢測樣品。圖2 16S rRNA凝膠電泳圖

2.3中藥單體對H.parasuis分離株的最小抑菌濃度(MIC) 14種中藥單體對H.parasuis的最小抑菌濃度結(jié)果如表1。

3 討論

近年來，豬群對抗生素的依賴性不斷增加，研究發(fā)現(xiàn)已經(jīng)出現(xiàn)對青霉素、氨芐西林、頭孢菌素、慶大霉素、壯觀霉素、氟甲砜霉素、增效磺胺、硫化酰胺及氟喹諾酮類耐藥的H.parasuis，大量菌株對四環(huán)素、紅霉素、氨基糖苷類和林可霉素有明顯的抵抗力。隨著對中藥研究的深入， 大量的報(bào)道顯示許多中藥具有抑菌殺菌的作用，且沒有出現(xiàn)耐藥的情況。中藥的成分多種多樣，中藥的活性物質(zhì)也多種多樣，因此其抑菌殺菌的機(jī)制也更加全面[4-5]。本次試驗(yàn)表明，以鹽酸小檗堿抑菌效果最好，MIC為16 μg/mL，大多維持在64-128 μg/mL之間。許多不具備抑菌作用的中藥，對病原菌依舊有效。無殘留且不易產(chǎn)生耐藥性的中藥，有潛力成為新型的抗生素。

表1 14種中藥單體對H.parasuis的最小抑菌濃度結(jié)果

[1] 郭蕊.副豬嗜血桿菌病細(xì)菌分離及PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J].今日畜牧獸醫(yī),2015(5):26-28.

[2] 范國英,劉俊偉,王順崗,等.副豬嗜血桿菌病的診斷與治療試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2011(12):82-83.

[3] Head N E, Yu H.Cross-sectional analysis of clinical and environmental isolates of pseudomonas aeruginosa: Biofilm formation, virulence and genome diversity [J]. Infect Immun, 2004,72(1):133-144.

[4] 傅若秋,盧來春,李卓恒,等.31種中藥單體對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抗菌作用研究[J].中國藥業(yè),2014,23(4):20-22.

[5] 范國英,劉俊偉,王順崗,等.副豬嗜血桿菌病的診斷與治療試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2011(12):82-83.