靶向高通量測序在非小細胞肺癌中的臨床應用*

最新數(shù)據(jù)表明，肺癌是我國發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤［1］。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌最為常見的組織學類型，占總體的80%～85%［2］。近些年，隨著基因組學和轉化醫(yī)學的快速發(fā)展，人們對NSCLC的認識已經(jīng)從組織水平深入到分子水平，越來越多的腫瘤驅動基因被逐漸發(fā)現(xiàn)。同時，基于各種驅動基因變異的靶向治療在臨床上表現(xiàn)出極大的抗腫瘤活性，為NSCLC的治療開辟了一條新的道路。如應用表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、奧西替尼等治療攜帶EGFR突變的NSCLC患者，克唑替尼治療攜帶ALK融合基因、ROS1融合基因、MET擴增和14外顯子跳躍突變的NSCLC患者，卡博替尼、凡德他尼治療攜帶RET重排的患者。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南中，建議對NSCLC患者進行至少8種與NSCLC個性化治療方案高度相關的驅動基因并行檢測，以確定最佳的治療方案。

DNA高通量測序（next-generation sequencing，NGS）是一種大規(guī)模并行測序的技術，可用作檢測多種DNA變異形式，包括點突變、小片段插入缺失、基因重排和拷貝數(shù)變異等。靶向高通量測序可以針對特定的基因區(qū)域進行準確高效的深度測序而篩選潛在藥物靶點，給癌癥患者提供更多的治療選擇和預后提示。本研究針對212例NSCLC樣本中8種與NSCLC個性化治療方案高度相關的點突變、小片段插入缺失、基因重排及拷貝數(shù)變異進行高通量測序，以分析不同類型基因變異與臨床病理特征的關系，為臨床醫(yī)生的個體化診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院于2016年6月至2017年8月212例NSCLC腫瘤患者。其中94例為手術樣本、96例為穿刺病理樣本、10例為胸腔積液樣本、12例為石蠟包埋（FFPE）腫瘤樣本。男性患者106例，女性患者106例，中位年齡為60（25～88）歲。所有病例均經(jīng)病理確診為肺癌，其中肺腺癌171例、肺鱗癌27例、其余14例。本研究獲得了患者的書面知情同意書，并通過了天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查批準。

1.2 方法

1.2.1 取材 新鮮組織（手術樣本/切檢穿刺樣本），胸腔積液樣本和FFPE樣本。使用DNA提取試劑盒QIAamp DNA Mini Kit（德國Qiagen公司）提取新鮮組織和胸腔積液樣本DNA。使用DNA提取試劑盒QIAamp FFPE DNATissue Kit（德國Qiagen公司）提取FFPE樣本DNA。使用朗克Lung CureTM8種基因試劑盒（廣州燃石公司）構建高通量測序文庫，對EGFR（突變、拷貝數(shù)）、KRAS（突變）、BRAF（突變）、ALK（突變、融合）、MET（突變、拷貝數(shù)）、ERBB2（突變、拷貝數(shù)）、ROS1（突變、融合）、RET（突變、融合）8種NCCN指南中明確與NSCLC個性化治療高度相關的基因突變、重排、拷貝數(shù)的變異情況進行檢測。使用300循環(huán)測序試劑（MiSeq Reagent Micro Kit v2，300 cycles），采用MiSeq測序儀（美國Illumina公司）進行測序。

1.2.2 生物信息學分析 使用序列比對軟件BWA（版本0.7.10）將原始數(shù)據(jù)比對到人類參考基因組（hg19）。使用GATK 3.2、MuTect和VarScan進行序列本地比對優(yōu)化和變異識別。使用VarScan fpfilter模塊對變異進行過濾，過濾掉測序深度＜100×的位點。根據(jù)ExAC、1000 Genomes、dbSNP、ESP6500SI-V2數(shù)據(jù)庫，人群頻率＞0.1%的變異為胚系變異。使用ANNOVAR和SnpEff V3.6對變異位點進行注釋。使用Tophat2和Factera

1.4.3 對基因融合進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料的比較采用t檢驗，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。所有比較均為雙側檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 數(shù)據(jù)質量評估和位點篩選

每個樣本產(chǎn)生的總測序數(shù)據(jù)量約為125 640～1882 140讀段，平均841 667讀段。對于二代測序目標區(qū)域，平均中位測序深度913×。全組樣本中，96.7%（205/212）的樣本＞80%目標測序區(qū)域的平均測序深度＞200×。98.1%（208/212）的樣本DNA插入片段長度≥170 bp。100%的樣本Q30＞80%。99.5%（211/212）的樣本文庫復雜度＞25%，測序數(shù)據(jù)的可靠性高。經(jīng)過生物信息分析，過濾掉非目標區(qū)突變、同義突變、胚系突變、低質量突變，最終得到215個高質量非同義突變用于后續(xù)分析。

2.2 基因變異在NSCLC患者中的分布

對212例NSCLC標本中8種基因的變異圖譜進行分析（圖1）。8種基因中，EGFR基因發(fā)生改變占比最高為52.8%，其次為KRAS（8.5%）ALK（8.0%）、ERBB2（6.1%）、MET（3.8%）、BRAF（1.4%）、RET（0.9%）、ROS1（0.9%），發(fā)現(xiàn)75%（159/212）的樣品至少檢出1個驅動基因變異，且驅動基因間呈現(xiàn)強烈互斥。

本研究對EGFR變異的類型及分布情況進行了分析，發(fā)現(xiàn)最常見的EGFR基因突變位點集中在EGFR基因的外顯子19和21，分別占40%，18、20外顯子及其他外顯子的分布所占比例較少，分別占4%、9%和7%。EGFR存在多種突變類型，最常見的19外顯子缺失、L858R突變分別占22.6%、22.2%。在所觀察的樣本中，EGFR 19外顯子缺失亞型分析，發(fā)現(xiàn)存在13種突變亞型，最常見的是p.E746_A750del，約占60.4%，其余少見亞型占39.6%。

EGFR 19外顯子缺失、L858R呈現(xiàn)出明顯的互斥現(xiàn)象，而所有檢測到的T790M突變都與上面兩個突變位點伴隨出現(xiàn)。除了T790M的伴隨出現(xiàn)，還對19外顯子缺失和L858R突變是否攜帶非EGFR T790M突變進行了比較。結果表明，存在19外顯子缺失患者攜帶非EGFR T790M突變比例低于L858R突變患者攜帶非EGFR T790M突變的趨勢（6.3%vs.21.3%，P=0.04），提示EGFR 19外顯子缺失相較于L858R突變，可能致病程度更高。此外，15.2%（17/112）EGFR突變伴有EGFR擴增，攜帶EGFR擴增且EGFR突變率＞40%的患者比例高于無EGFR擴增患者且EGFR突變率＞40%的患者比例（82.4%vs.6.3%，P＜0.01）。

212例患者中，ALK變異檢出率為8.0%（17/212），存在3種變異類型，基因融合（包括EML4-ALK融合和其他罕見融合）、錯義突變和移碼突變。其中ALK融合在5.7%（12/212）NSCLC患者檢出，75%（9/12）為經(jīng)典EML4-ALK融合，經(jīng)典融合中EML4（外顯子6）-ALK（外顯子20）融合出現(xiàn)最多（4/9）；其次是EML4（外顯子13）-ALK（外顯子20）融合（2/9）。

212例患者中，檢測到3.8%（8/212）的樣本存在MET基因變異，包括3種類型：MET擴增、MET 14外顯子跳躍突變、MET錯義突變。其中MET 14外顯子跳躍突變在1.4%（3/212）NSCLC患者中檢出，MET擴增在0.5%（1/212）NSCLC患者中檢出。

此外，8.5%（18/212）樣本存在KRAS基因變異，其中83.3%（15/18）集中在12或13密碼子。1.4%（3/212）樣本存在BRAF基因變異，均為V600附近突變（p.N581D，p.K601E，p.D594A）。ERBB2變異在6.1%（13/212）的NSCLC患者檢出，其中38.5%為20外顯子插入，0.9%NSCLC患者檢出ERBB2擴增。

2.3 基因變異與臨床病理的關系

212例患者中206例有臨床病理信息。觀察常見驅動基因變異與年齡、性別、腫瘤位置（5例腫瘤原發(fā)為雙側的病例不納入分析）、吸煙史、病理分型、臨床分期、淋巴結轉移（2例淋巴結轉移狀態(tài)未知的病例不納入分析）、轉移、治療情況的關系（表1）。攜帶非KRAS突變患者的年齡顯著較?。郏?9±9）歲vs.（63±8）歲，P=0.005］，而攜帶KRAS G12X突變的患者年齡較大［（65±7）歲vs.（60±9）歲，P=0.055］；攜帶ALK融合基因的患者平均年齡顯著小于不攜帶此融合基因的患者［（55±10）歲vs.（61±9）歲，P=0.031］。在檢測中，女性、不吸煙以及腺癌患者易發(fā)生EGFR特別是EGFR敏感突變（P＜0.01，表2），女性患者中66.0%（68/103），非吸煙患者中64.1%（66/103）、腺癌患者中56.8%（96/169）攜帶EGFR敏感突變（表2）。與鱗癌相比，腺癌患者攜帶EGFR擴增的占比更高（腺癌vs.鱗癌為9.5%vs.0，P=0.013），并且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期攜帶EGFR擴增的患者明顯增加（Ⅰvs.Ⅱvs.Ⅲvs.Ⅳ為3.0%vs.15.4%vs.18.9%vs.9.0%，P=0.048），有淋巴結轉移攜帶EGFR擴增的患者明顯增加（13.8%vs.4.8%，P=0.027，表2）。男性，左側肺癌，吸煙患者KRAS突變的發(fā)生率較高（P=0.009，P=0.048，P=0.037，表2）。初診和復治患者的突變譜無明顯差異。而對于本研究中的低頻突變，BRAF、RET和ROS1基因變異和患者的臨床病理關系見表3。

?圖1 8種基因的變異圖譜

表1 驅動基因突變與臨床病理的關系 例

表2 KRAS、ALK、EGFR基因突變與臨床病理的關系

表2 KRAS、ALK、EGFR基因突變與臨床病理的關系（續(xù)表2）

表3 攜帶低頻基因變異患者的臨床病理特征

3 討論

隨著高通量測序技術的進步，以基因檢測為基礎的臨床診療在NSCLC治療模式中日益廣泛，是改善患者臨床預后的最佳例證之一［3］。NCCN指南中明確指出須對8種與NSCLC個性化治療高度相關的基因突變、重排、拷貝數(shù)的變異情況進行檢測以確定晚期NSCLC最佳的治療方案。一代測序即Sanger測序是當今基因檢測的金標準，但其測序效率低、通量小、成本高，因此，準確、高通量及經(jīng)濟-效益比更高的基因檢測方法對惡性腫瘤個體化精準治療有重要意義。高通量測序可以同時對多種基因多種變異類型進行分析，并能定量檢測基因突變率，為臨床醫(yī)師提供全面信息［4］。隨著精準醫(yī)療的快速發(fā)展，越來越多的醫(yī)療機構可以提供小基因組合（panel）的高通量測序，檢測數(shù)據(jù)的生物信息分析和變異解讀相對容易快捷，患者經(jīng)濟負擔小，并且短時間內(nèi)即可獲得針對性強的檢測報告并制定下一步治療計劃。但和美國FDA批準的紀念斯隆凱特琳癌癥研究中心（MSK）的癌癥基因檢測分析平臺MSK-IMPACT和美國Foundation Medicine公司的FoundationOne CDx（F1CDx）高通量測序相比，小panel的高通量測序往往支持單一癌種的檢測以指導治療，不能揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制以及腫瘤突變負荷的評估。本研究中，對治療指南中的8種基因進行高通量測序，觀察在我國NSCLC患者中的變異情況。

EGFR是NSCLC最常見的突變基因，本研究的檢測中EGFR基因變異發(fā)生率為52.8%，符合亞洲人群中EGFR變異頻率。最常發(fā)生的EGFR基因突變位點為19外顯子缺失、L858R突變，19外顯子缺失亦存在多種亞型。和傳統(tǒng)的方法相比，NGS檢測EGFR基因變異類型更全面，可以提高EGFR19外顯子突變的檢出率，使更多的患者受益。除了常見的EGFR突變外，也觀察到了EGFR少見突變，少見突變對EGFR-TKI有效率低于常見突變，但少見突變相關的臨床隨機數(shù)據(jù)相對較少，存在異質性。212例患者中，32例（15.1%）患者存在EGFR基因內(nèi)共存改變。T790M突變是TKI最常見的獲得性耐藥機制，原發(fā)T790M突變率低，本研究檢測到攜帶T790M突變均為繼發(fā)性耐藥的患者，無原發(fā)耐藥患者。4例（1.9%）患者為T790M與EGFR19外顯子缺失或L858R共存出現(xiàn)的復治患者，而19外顯子缺失患者攜帶非EGFR T790M突變比例低于L858R突變患者攜帶非EGFR T790M突變比例的趨勢，提示相較于L858R突變，19外顯子缺失可能是致病程度更高的突變。

盡管EGFR存在TKI敏感位點，但TKI的耐藥不可避免，EGFR 20外顯子突變是TKI原發(fā)耐藥的原因之一，突變率約2%，有效率10%，本研究陽性檢出率為1.9%，和文獻報道［5］相近；盡管20外顯子突變會激活EGFR，但未增加激活的EGFR受體與TKI結合力；而20外顯子A763_Y764insFQEA突變對TKI有效［5］。

本研究存在EGFR擴增的患者中，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期攜帶EGFR擴增的患者明顯增加，有文獻報道，隨著患者TNM分期的增高，EGFR擴增率呈增加的趨勢［6］，EGFR擴增可能與腫瘤進展相關［7］。本結果提示有淋巴結轉移的患者中，攜帶EGFR擴增的患者占14%，是無淋巴結轉移患者的3倍。有文獻報道［7］，有淋巴結轉移的肺癌患者中，EGFR擴增率可高達90%，幾乎是無淋巴結轉移患者攜帶率的2倍，這意味著EGFR擴增可能與NSCLC的侵襲轉移以及疾病進展有關。

突變豐度與靶向治療效果密切相關，Li等［8］研究發(fā)現(xiàn)血液中EGFR突變豐度高，肺癌患者靶向治療效果好，中位生存期更長。結果提示存在EGFR突變患者中，攜帶EGFR擴增患者且EGFR突變率＞40%的患者明顯多于不攜帶EGFR擴增患者且EGFR突變率＞40%患者，這可能提示EGFR突變豐度高，且攜帶EGFR擴增患者容易出現(xiàn)臨床分期較晚有淋巴結轉移的臨床特征。有研究［9］提示EGFR-TKI在肺癌輔助治療中顯示了較好的療效，也就意味著EGFR-TKI在非晚期肺癌患者呈現(xiàn)出治療療效，而同時攜帶EGFR高豐度突變和EGFR擴增非晚期患者的靶向治療療效需要進一步觀察。

ALK融合是肺癌重要的驅動基因，在檢測中8.0%患者存在ALK基因變異，ALK融合的陽性檢出率為5.7%，其中EML4-ALK是最常見的融合類型，占融合類型的75%。攜帶ALK突變，特別是攜帶ALK融合基因的患者平均年齡為55歲，顯著小于不攜帶此融合基因的患者，這和文獻報道相符［10］。12例ALK融合陽性的患者中，9例繼續(xù)行ALK（D5F3）免疫組織化學方法的驗證，結果表明9例（100%）結果陽性，也說明了高通量測序的ALK融合檢出和免疫組織化學方法一致性很高，高通量測序的方法可以作為免疫組織化學ALK融合檢測的備選手段。在結果中也可以看到，檢測到3例ALK罕見融合類型（1例KLC1-ALK、1例TMEM17-ALK、1例LTBP1-ALK）約占1.4%，其中TMEM17-ALK和LTBP1-ALK為兩例罕見融合尚未見報道，機制需進一步探索，但根據(jù)文獻報道，一旦發(fā)現(xiàn)ALK融合，不論與其融合的配體是來自哪個基因，可能對ALK抑制劑敏感［11］。此外，有報道提示非EML4-ALK融合發(fā)生率很低，400例NSCLC只檢測到3例陽性患者，發(fā)生率約為0.75%，可能由于樣本例數(shù)的限制和人群的不同，本研究的非EML4-ALK融合陽性率相對高，并且由于文獻中罕見ALK融合大部分為個案報道，尚需進一步研究［12］。

KRAS基因突變在吸煙男性中發(fā)生比例顯著高于女性，和之前報道一致［13］，此外，本研究KRAS基因突變的患者中，特別是KRAS-G12X位點突變的患者，左側肺癌發(fā)生率較右側高，提示腫瘤原發(fā)灶的位置可能與突變相關，但機制尚不明確，也可能受樣本量的限制。在結直腸癌中發(fā)現(xiàn)，KRAS基因突變在原發(fā)部位為右半結腸癌的患者中發(fā)生率較高［14］，也提示KRAS突變與腫瘤原發(fā)病灶位置具有一定的相關性。

歐美的研究結果顯示，非鱗NSCLC患者由MET 14外顯子跳躍引起的MET基因突變率為3%～4%［15-16］。而本研究結果顯示，3.8%（8/212）樣本存在MET基因變異，而MET 14外顯子跳躍突變在1.4%（3/212）NSCLC患者檢出，低于歐美國家。Liu等［17］研究結果提示，MET 14外顯子跳躍突變僅在0.9%的中國肺腺癌患者中發(fā)生，Zheng等［18］研究結果提示，MET 14外顯子跳躍突變在1.3%中國NSCLC患者中發(fā)生，均低于既往國外研究的結果?？赡苁怯捎诜N族差異，在我國NSCLC患者中MET 14外顯子跳躍突變率低于歐美人群。

本研究檢測到1.4%（3/212）樣本存在BRAF變異。檢測的肺癌患者中，BRAF突變均為非經(jīng)典的V600E突變，為V600附近突變（p.N581D，p.K601E，p.D594A），提示非V600E突變在NSCLC中是重要的亞型之一。文獻報道BRAF V600E是重要的驅動基因，其中約一半的黑色素瘤患者存在BRAF V600E突變。在NSCLC中，2%～4%患者存在BRAF突變，55%突變?yōu)閂600E，35%為G469A，15%為D594G，其中攜帶V600E突變的NSCLC對達拉非尼和曲美替尼聯(lián)合治療有效［19］，攜帶K601E的惡性黑色素瘤患者對曲美替尼有效［20］，而N581用藥效果尚不明確。

因此，使用高通量測序技術對8種與肺癌個性化治療方案高度相關的基因進行測序，揭示了NSCLC患者的變異情況以及臨床病理特征，為臨床醫(yī)生的個體化診療提供了參考。此外，NSCLC的基因檢測從最初單基因檢測發(fā)展到NCCN指南推薦的多基因檢測，使NSCLC更加趨向細化診斷以及精準治療。以多基因為基礎的高通量測序為NSCLC的診療提供了更多的可能性。

[1]Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[2]Davidson MR,Gazdar AF,Clarke BE.The pivotal role of pathology in themanagement of lungcancer[J].J Thorac Dis,2013,5(Suppl 5):S463-478.

[3]Sheikine Y,Kuo FC,Lindeman NI.Clinical and technical aspects of genomic diagnostics for precision oncology[J].J Clin Oncol,2017,35(9):929-933.

[4]McGinn S,Gut IG.DNA sequencing-spanning the generations[J].N Biotechnol,2013,30(4):366-372.

[5]Castellanos E,Feld E,Horn L.Driven by Mutations:The predictive Value of Mutation Subtype in EGFR-Mutated Non-Small Cell Lung cancer[J].J Thorac Oncol,2017,12(4):612-623.

[6]Jia XF,Li J,Zhao HB,et al.Correlation of EGFR gene amplification with invasion and metastasis of non-small cell lung cancer[J].Genet Mol Res,2015,14(3):11006-11012.

[7]Yatabe Y,Takahashi T,Mitsudomi T.Epidermal growth factor receptor gene amplification is acquired in association with tumor progression of EGFR-mutated lung cancer[J].Cancer Res,2008,68(7):2106-2111.

[8]Li X,Cai W,Yang G,et al.Comprehensive analysis of EGFR-Mutant Abundance and Its Effect on Efficacy of EGFR TKIs in Advanced NSCLC with EGFR mutations[J].J Thorac Oncol,2017,12(9):1388-1397.

[9]Zhong WZ,Wang Q,Mao WM,et al.Gefitinib versus vinorelbine plus cisplatin as adjuvant treatment for stage II-IIIA(N1-N2)EGFR-mutant NSCLC(ADJUVANT/CTONG1104):a randomised,open-label,phase 3 study[J].Lancet Oncol,2018,19(1):139-148.

[10]Shaw AT,Yeap BY,Mino-Kenudson M,et al.Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer who harbor EML4-ALK[J].J Clin Oncol,2009,27(26):4247-4253.

[11]Jiang J,Wu X,Tong X,et al.GCC2-ALK as a targetable fusion in lung adenocarcinoma and its enduring clinical responses to ALK inhibitors[J].Lung Cancer,2018,115:5-11.

[12]Iyevleva AG,Raskin GA,Tiurin VI,et al.Novel ALK fusion partners in lung cancer[J].Cancer Lett,2015,362(1):116-121.

[13]Liu L,Liu J,Shao D,et al.Comprehensive genomic profiling of lung cancer using a validated panel to explore therapeutic targets in East Asian patients[J].Cancer Sci,2017,108(12):2487-2494.

[14]高靜,孫志偉,李艷艷,等.中國結直腸癌患者966例中KRAS和BRAF基因突變分析[J].中華病理學雜志,2012,41(9):579-583.

[15]Frampton GM,Ali SM,Rosenzweig M,et al.Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors[J].Cancer Discov,2015,5(8):850-859.

[16]Paik PK,Drilon A,Fan PD,et al.Response to MET inhibitors in patients with stage IV lung adenocarcinomas harboring MET mutations causing exon 14 skipping[J].Cancer Discov,2015,5(8):842-849.

[17]Liu SY,Gou LY,Li AN,et al.The Unique characteristics of MET Exon 14 Mutation in Chinese patients with NSCLC[J].J Thorac Oncol,2016,11(9):1503-1510.

[18]Zheng D,Wang R,Ye T,et al.MET exon 14 skipping defines a unique molecular class of non-small cell lung cancer[J].Oncotarget,2016,7(27):41691-41702.

[19]Sereno M,Moreno V,Moreno RJ,et al.A significant response to sorafenib in a woman with advanced lung adenocarcinoma and a BRAF non-V600 mutation[J].Anticancer Drugs,2015,26(9):1004-1007.

[20]Bowyer SE,Rao AD,Lyle M,et al.Activity of trametinib in K601E and L597Q BRAF mutation-positive metastatic melanoma[J].Melanoma Res,2014,24(5):504-508.