前列腺癌冷凍消融聯(lián)合抗CTLA-4抗體增強(qiáng)小鼠腫瘤引流淋巴結(jié)免疫反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究*

楊伊 張浩楠 李鳳娥 司同國(guó)

冷凍消融作為一種介入治療手段，可作為局限性前列腺癌（prostate cancer，PCa）的一線治療手段［1-2］。冷凍消融后，PCa壞死組織所釋放的大量腫瘤相關(guān)抗原及細(xì)胞因子等引起樹突狀細(xì)胞活化，從而激活效應(yīng)T細(xì)胞以發(fā)揮腫瘤免疫反應(yīng)（anti-tumor immune response，ATIR），又稱“冷凍免疫反應(yīng)”［3］。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulator T cell，Treg）是一個(gè)具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，在腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮重要的作用［4-5］。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）是Treg表面的一種免疫檢查點(diǎn)［6］，CTLA-4不僅可以通過與CD28競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗原提呈細(xì)胞表面的CD80（B7）阻斷共刺激信號(hào)，產(chǎn)生免疫抑制作用，還能夠傳遞抑制性信號(hào)，抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的增殖與活化，進(jìn)而抑制其抗腫瘤作用［6］。本研究旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探究冷凍消融聯(lián)合抗CTLA-4抗體治療對(duì)腫瘤引流淋巴結(jié)（tumor draining lymph nodes，TDLNs）中Treg和CTL免疫功能狀態(tài)的改變，及其對(duì)小鼠總生存期（overall survival，OS）的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠PCa細(xì)胞（RM-1）株由復(fù)旦大學(xué)細(xì)胞庫提供。清潔級(jí)純種近交系C57BL/6（H-2Db/b）7～9周雄性小鼠100只購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，體質(zhì)量17～23 g，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。100只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照（A）組，冷凍消融治療（B）組，冷凍消融聯(lián)合抗CTLA-4抗體治療（C）組，抗CTLA-4抗體治療（D）組。本實(shí)驗(yàn)遵從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基本管理?xiàng)l例和動(dòng)物倫理學(xué)條例。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑 氬氦冷凍消融系統(tǒng)購自美國(guó)Endocare公司，流式細(xì)胞儀購自美國(guó)BD公司，PBS緩沖液購自北京中杉公司，F(xiàn)BS胎牛血清購自美國(guó)Hyclone公司，紅細(xì)胞裂解液購自上海哈靈公司，抗CTLA-4抗體購自美國(guó)Bioss公司，F(xiàn)ixation&Permeabilization Buffer購自美國(guó)eBioscience公司，抗CD4-PerCP、抗CD8-PE/Cy7、抗FOXP3-Alexa Flour 488、抗CD25-PE流式抗體及相應(yīng)同型對(duì)照購自美國(guó)Biolegend公司，乳酸脫氫酶（LDH）殺傷實(shí)驗(yàn)試劑盒購自美國(guó)Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 PCa小鼠模型建立 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，使用PBS溶液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/mL，將100 μL RM-1細(xì)胞重懸液接種于小鼠右腹股溝皮下，每天觀察腫瘤生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.2 冷凍消融 待腫瘤生長(zhǎng)直徑為0.8～1.0 cm時(shí)，將小鼠固定在無菌操作臺(tái)上，術(shù)區(qū)備皮、消毒、鋪巾，采用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，在瘤旁切開約1.5 mm的切口，將直徑2.0 mm的氬氦刀插入瘤體中心部位。A組未治療。B組行2次冷凍消融治療，每次先啟動(dòng)氬氣，控制冷凍時(shí)間約30 s，冰球完全覆蓋腫瘤，瘤體表面完全覆蓋白色凍霜，中心約-115℃，再啟動(dòng)氦氣，復(fù)溫至10℃后，撤出氬氦刀，皮膚縫合，肌注慶大霉素（8萬U/d）3天預(yù)防感染。C組方法同B組，并給予抗CTLA-4抗體（50 μg/只）腹腔注射。D組給予抗CTLA-4抗體（50 μg/只）腹腔注射。

1.2.3 標(biāo)本采集 各組分別于治療前及治療后7、14、21天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取各組5只小鼠，測(cè)量腫瘤大小并采集標(biāo)本。高濃度CO2處死小鼠，瘤旁皮膚消毒并切開，手術(shù)鉗行鈍性分離，于股動(dòng)靜脈鞘上方解剖分離TDLNs標(biāo)本，配合PBS沖洗液于濾網(wǎng)內(nèi)研磨均勻，加入紅細(xì)胞裂解液混勻，使用10%FBS培養(yǎng)液配置單細(xì)胞懸液。生存起點(diǎn)定義為小鼠接受治療的時(shí)間點(diǎn)，生存終點(diǎn)定義為小鼠治療后的自然死亡時(shí)間。記錄各組最后5只小鼠OS。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 取100 μL TDLNs細(xì)胞懸液加入流式管，分別在實(shí)驗(yàn)組的標(biāo)本管中，以抗CD4-PerCP、抗CD8-PE/Cy7流式抗體標(biāo)記CTL，以抗CD4-PerCP、抗CD25-PE流式抗體分選Treg后使用Fixation&Permeabilization Buffer固定破膜處理30 min，以抗FOXP3-Alexa Flour 488流式抗體標(biāo)記Treg；同時(shí)分別設(shè)置相應(yīng)的同型對(duì)照管。分別使用PBS配制200 μL細(xì)胞重懸液，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 LDH細(xì)胞殺傷檢測(cè) 取TDLNs細(xì)胞懸液中分離出CD8+T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，RM-1細(xì)胞作為靶細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按效靶比20：1混合，LDH法檢測(cè)細(xì)胞殺傷活性。同時(shí)設(shè)本底組、自然釋放組、最大釋放組、機(jī)體校正組，計(jì)算殺傷率。殺傷率（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組吸光度-靶細(xì)胞自然釋放組吸光度）/（最大釋放組吸光度-靶細(xì)胞自然釋放組吸光度）×100%。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，繪圖采用GraphPad Prism 6軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，各時(shí)間點(diǎn)組間比較采用ANOVA方差分析、兩樣本的比較采用t檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同治療方法對(duì)TDLNs中Treg比例的影響

治療后14天與A組FOXP3+Treg比例相比，B、C組均下降（均P＜0.05）；與D組FOXP3+Treg比例相比，B、C組均下降（均P＜0.05）。治療后21天B、C組中FOXP3+Treg比例恢復(fù)至治療前（表1，圖1）。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TDLNs中的Treg比例（n=25）

圖1 治療后14天各組FOXP3+Treg比例變化

2.2 不同治療方法對(duì)TDLNs中CTL比例的影響

治療后14天與A組CD8+CTL比例相比，B、C、D組均增加（P＜0.05、P＜0.001、P＜0.05）；C組CD8+CTL比例較B、D組顯著增加（均P＜0.001）。治療后21天C、D組CD8+CTL比例均較A組增加（均P＜0.05）；C、D組CD8+CTL比例均較B組增加（均P＜0.05）。見表2，圖2。

2.3 不同治療方法對(duì)CTL殺傷活性的影響

治療后7天C組CTL殺傷活性較A、B、D組升高（均P＜0.05）。治療后14天與A組CTL殺傷活性相比，B、C、D組均升高（P＜0.05、P＜0.001、P＜0.05）；C組CTL殺傷活性較B、D組升高（均P＜0.05）。治療后21天與A組CTL殺傷活性相比，C、D組均升高（均P＜0.001）。見表3。

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TDLNs中CD8+CTL比例（n=25）

圖2 治療后14天各組CD8+CTL比例變化

表3 TDLNs中CTL對(duì)RM-1細(xì)胞的殺傷活性（n=25）

2.4 不同治療方法對(duì)腫瘤大小及小鼠OS的影響

與A組腫瘤體積相比，B、C、D組均縮?。≒＜0.05、P＜0.001、P＜0.05）；B組與D組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。C組腫瘤體積較B、D組均顯著縮?。ň鵓＜0.05）。冷凍消融治療或抗CTLA-4抗體治療后腫瘤體積縮小，聯(lián)合治療后腫瘤體積縮小更顯著（表4）。

A、B、C、D組OS分別為（25.60±1.52）天、（34.20±6.98）天、（43.60±2.88）天、（31.00±4.64）天。與A組小鼠OS相比，B、C組均延長(zhǎng)（P＜0.05、P＜0.001）。C組小鼠OS較B、D組顯著延長(zhǎng)（P＜0.05、P＜0.001）。冷凍消融治療使小鼠OS延長(zhǎng)，聯(lián)合治療效果更加顯著（圖3）。

表4 各組腫瘤大小變化（n=25）

圖3 各組小鼠總體生存曲線

3 討論

近年來，我國(guó)PCa發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，占男性惡性腫瘤的第6位［7］。對(duì)于早期PCa，冷凍消融治療的效果可以達(dá)到外科根治術(shù)水準(zhǔn)［8］，同時(shí)也可作為中晚期PCa的補(bǔ)救治療［9-10］，但單純冷凍消融不能完全控制腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，其引發(fā)的“冷凍免疫反應(yīng)”有可能作為突破治療瓶頸的關(guān)鍵點(diǎn)。Treg是對(duì)ATIR產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控作用的一個(gè)重要因素，CTL則是ATIR中產(chǎn)生腫瘤殺傷效應(yīng)的一個(gè)重要因素?？笴TLA-4抗體可以阻斷Treg表面的CTLA-4與CD80結(jié)合，從而增強(qiáng)CTL功能并增強(qiáng)ATIR［11］。距離PCa原發(fā)病灶最近的TDLNs是機(jī)體中重要的免疫監(jiān)視場(chǎng)所，因其含有大量的免疫細(xì)胞，最先產(chǎn)生ATIR；在腫瘤進(jìn)展的過程中，TDLNs逐漸產(chǎn)生免疫耐受甚至免疫抑制，故其成為PCa轉(zhuǎn)移的第一個(gè)組織，因此，TDLNs在PCa的發(fā)展中具有重要的監(jiān)測(cè)價(jià)值。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比冷凍消融對(duì)下調(diào)Treg比例及上調(diào)CTL比例有一定作用，在降低Treg負(fù)性調(diào)節(jié)作用和增強(qiáng)CTL殺傷活性的同時(shí)加強(qiáng)ATIR，腫瘤體積顯著縮小，荷瘤小鼠OS延長(zhǎng)。值得注意的是，單純抗CTLA-4抗體治療雖未明顯引起Treg比例變化，荷瘤小鼠OS也無明顯變化，但卻上調(diào)了CTL比例，至治療后21天仍保持逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)，此時(shí)CTL殺傷活性持續(xù)增強(qiáng)，腫瘤體積顯著縮小，ATIR持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，提示抗CTLA-4抗體影響CTL效應(yīng)，但與Treg數(shù)量無關(guān)，可能與阻斷Treg負(fù)性調(diào)節(jié)信號(hào)，增加正性共刺激信號(hào)的分子功能有關(guān)。本研究還顯示，聯(lián)合治療對(duì)下調(diào)Treg比例及上調(diào)CTL比例的效果顯著，且持續(xù)治療21天后，此時(shí)CTL殺傷活性持續(xù)增強(qiáng)，ATIR明顯加強(qiáng)，與單純冷凍消融或抗CTLA-4抗體治療相比，腫瘤體積縮小更加顯著，荷瘤小鼠OS得到明顯延長(zhǎng)。

Waitz等［12］發(fā)現(xiàn)，對(duì)小鼠左側(cè)PCa移植瘤行冷凍消融后，在右側(cè)種植PCa移植瘤，并給予抗CTLA-4抗體治療后腫瘤微環(huán)境和脾臟中CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著增加，腫瘤內(nèi)效應(yīng)T細(xì)胞與Treg數(shù)量之比提高，機(jī)體提高了對(duì)第二個(gè)腫瘤的抵抗性，小鼠OS延長(zhǎng)。Benzon等［13］在同一小鼠腹部?jī)蓚?cè)分別種植一大一小兩個(gè)PCa移植瘤，在注射抗CTLA-4抗體2天后，對(duì)大種植瘤進(jìn)行冷凍消融治療。該研究中的單純抗CTLA-4抗體治療組既未減緩腫瘤生長(zhǎng)也未延長(zhǎng)小鼠OS，與單純冷凍消融組相比，聯(lián)合治療組的小種植瘤生長(zhǎng)推遲了14.7天，小鼠死亡率下降4倍，提示聯(lián)合治療具有協(xié)同作用并對(duì)小種植瘤產(chǎn)生“遠(yuǎn)位效應(yīng)”。聯(lián)合治療組Treg和CD8+T細(xì)胞比例均有所上升，但是二者比值卻未發(fā)生明顯改變，與本研究得出的ATIR與Treg數(shù)量無關(guān)的結(jié)論具有一致性，有待進(jìn)一步探究Treg影響ATIR的具體作用機(jī)制。

本研究通過探討冷凍消融聯(lián)合抗CTLA-4抗體對(duì)Treg及CTL的影響，提示免疫檢查點(diǎn)CTLA-4可能是抑制Treg功能的重要分子靶點(diǎn)，冷凍消融聯(lián)合免疫治療可能是提高ATIR的治療方案，為PCa的系統(tǒng)治療提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有臨床指導(dǎo)意義。

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