草血竭純化部分對小鼠甲型H1N1流感的療效

高 慧，肖芙蓉，許小珍，林 鋒，張秀春，吳 彪，趙貴先

(海南省人民醫(yī)院, 海南 海口 570311)

流行性感冒(influenza，F(xiàn)lu)具有高度的傳染性，發(fā)病率高，病死率高，是危害人類健康的一種重要感染性疾病。特別是近年來甲型H1N1流感病毒感染在全世界范圍內(nèi)暴發(fā)流行，引起了全球的重視[1]。雖然奧司他韋是公認治療甲型流感病毒的有效藥物，但已有耐藥的報道，且目前對于流感有確切療效的藥物較少，勢待研發(fā)新的藥物。草血竭(Polygonum paleaceum Wall，PPW)為蓼科植物的根莖，已有實驗證明其對急性炎癥有一定的治療作用。本文擬在流感病毒感染動物模型上觀察其抗流感病毒的效果。

1 材料與方法

1.1 材料 甲型H1N1 流感病毒Yamagata/120/86/H1N1 株由日本福島醫(yī)科大學微生物系錫谷達夫教授惠贈，血凝滴度：1∶1 280。動物：4～5 周齡Balb/c 小鼠，體重(11±1)g，購自海南省人民醫(yī)院實驗動物中心，合格證號：SCXK(鄂)4200593224。幼犬腎(Madin-Darby Canine Kidney, MDCK)細胞，本實驗室保存(購自上海細胞所)。

1.2 試劑 草血竭純化部分(0.283 g/mL生藥，湖北中醫(yī)藥大學生產(chǎn))。奧司他韋(達菲，75 mg/粒，巴塞爾豪夫邁·羅氏公司，瑞士)。實驗試劑：DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(GIBCO，美國)；青鏈霉素溶液(100×)(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；胰酶(Amresco 公司，美國)； TRAZOL (Invitrogen公司，美國)；逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、隨機引物(Promega 公司，美國)；2×PCR mix 和PCR Markers[天根生化科技(北京)有限公司]；SYBR Green Real-time PCR Master Mix(TOYOBO 公司，日本)；dNTPs (華美生物工程公司)；AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒[愛思進生物技術(shù)(杭州)有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 甲型 H1N1流感病毒對Balb/c 小鼠半數(shù)致死量(LD50)的測定 將病毒液用稀釋液按10 倍梯度稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-77 個稀釋度。取Balb/c小鼠48 只，隨機法分為8 組。乙醚輕度麻醉后，分別給予上述稀釋度的病毒液50 μL滴鼻，正常對照組使用無病毒的稀釋液滴鼻。每天觀察小鼠生存狀態(tài)，記錄14 d內(nèi)各組小鼠發(fā)病狀況，統(tǒng)計小鼠死亡數(shù)量，根據(jù)Reed-Muench 法計算流感病毒的LD50[2-3]。

1.3.2 實驗分組 Balb/c 小鼠，隨機分為6組：正常對照組、病毒對照組、陽性對照組(達菲45 mg/kg·d)、草血竭高劑量組(1 600 mg/kg·d)、草血竭中劑量組(800 mg/kg·d)、草血竭低劑量組(400 mg/kg·d)，每組7只。Balb/c 小鼠實驗前禁食禁水4 h，乙醚吸入麻醉后，以10×LD50病毒液滴鼻感染小鼠，每只小鼠的接種劑量為50 μL(正常對照組經(jīng)鼻腔滴入等量病毒稀釋液)。感染后2 h 通過灌胃途徑給予上述各劑量藥物，0.2 mL/只，連續(xù)給藥5 d，每天1 次。

1.3.3 療效評價 觀察14 d 內(nèi)甲型H1N1流感病毒感染模型小鼠的發(fā)病情況，記錄各組小鼠死亡數(shù)及存活日數(shù)。肺指數(shù)的測定：肺指數(shù)=小鼠肺重/小鼠體重×100%；肺指數(shù)抑制率=(病毒對照組肺指數(shù)-實驗組肺指數(shù))/病毒對照組肺指數(shù)×100%。最后一次灌胃給藥后繼續(xù)觀察24 h，小鼠處死前禁食禁水8 h 以上。稱重后先摘除眼球取血，再將小鼠斷椎處死，無菌取肺，用生理鹽水洗滌2～3 次，摘除氣管及肺門淋巴組織，置于濾紙上吸干水分后，精密天平稱重。肺組織內(nèi)病毒核酸載量：對肺組織勻漿提取RNA，采用標準曲線法定量同一樣本各組小鼠肺內(nèi)流感病毒M基因相對于GAPDH的表達量[4]。小鼠肺組織勻漿液，接種至已鋪滿單層的MDCK細胞上進行流感病毒擴增，血凝試驗法檢測流感病毒滴度[5-7]。

1.4 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差的形式表示。多組間比較采用方差分析，以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 甲型H1N1流感病毒對Balb/c小鼠LD50的測定 甲型H1N1流感病毒對Balb/c小鼠的LD50為10-6。見表1。

表1 甲型H1N1流感病毒對小鼠的LD50

2.2 草血竭純化部分對甲型H1N1流感病毒感染小鼠的作用 陽性對照組和草血竭高、中劑量組小鼠的存活率均為100%，平均生存日數(shù)均為14 d，草血竭低劑量組小鼠的存活率為42.86%，平均生存日數(shù)為9.14 d，而病毒對照組小鼠的存活率及平均生存日數(shù)分別為0 和3.57 d。 不同組別小鼠平均生存日數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=8.53，P=0.02)；陽性對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠平均生存日數(shù)均高于病毒對照組(P<0.05)。見表2。

2.3 草血竭純化部分對甲型H1N1流感病毒感染小鼠肺指數(shù)、肺組織病毒載量的影響 陽性對照組和草血竭純化部分各劑量組的肺指數(shù)、肺組織內(nèi)流感病毒核酸相對量和病毒滴度均低于病毒對照組(P<0.05)。而陽性對照組與草血竭純化部分各劑量組的肺指數(shù)、肺組織內(nèi)流感病毒核酸相對量和病毒滴度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表2草血竭純化部分對甲型H1N1 流感病毒感染小鼠的死亡保護作用

Table2Protection effect of extract of PPW on death of mice infected with influenza A H1N1 virus

組別死亡比例病死率(%)存活率(%)平均生存日數(shù)(x±s,d)高劑量組0/70.00100.0014.00±0.00*中劑量組0/70.00100.0014.00±0.00*低劑量組4/757.1442.869.14±4.56*陽性對照組0/70.00100.0014.00±0.00*病毒對照組7/7100.000.003.57±0.79正常組0/70.00-14.00±0.00

*：與病毒組比較，P<0.05

組別肺指數(shù)(%)肺指數(shù)抑制率(%)病毒核酸相對量病毒滴度高劑量組0.81±0.07*38.35±3.910.42±0.06*2.35±0.29*中劑量組0.84±0.10*34.13±2.250.42±0.06*2.43±0.15*低劑量組0.84±0.10*32.26±1.370.65±0.19*2.46±0.12*陽性對照組0.84±0.07*36.36±4.520.37±0.11*2.49±0.12*病毒對照組1.42±0.12 -1.00±0.062.80±0.16正常組0.77±0.07 - - -F 7.97 17.95 6.64 6.04P 0.03 0.00 0.04 0.04

*：與病毒組比較，P<0.05

3 討論

草血竭是一種使用廣泛的中草藥，蓼科植物的根莖，主要產(chǎn)于云南、貴州、四川三省。其味苦、澀，性溫和，有散血止血，下氣止痛治慢性胃炎，胃、十二指腸潰瘍，食積，癥瘕積聚，月經(jīng)不調(diào)，浮腫，跌打損傷，外傷出血、收斂止瀉之功效[8]。研究發(fā)現(xiàn)，草血竭有鎮(zhèn)痛抗炎作用[9]。另外，有研究報道草血竭水煮醇沉干浸膏與草血竭純化部分能夠在體外通過直接滅活作用發(fā)揮抗流感病毒作用[10]。因此，本研究通過給予甲型H1N1流感病毒感染小鼠不同劑量的草血竭純化部分，觀察其對小鼠的病死率、肺指數(shù)、肺組織病毒載量、病毒滴度的影響，綜合評價草血竭抗病毒效果。

小鼠是目前較為合適的流感感染動物模型[11]。同時呼吸道感染為流感病毒的自然感染方式。在小鼠和雪貂的動物模型中，通常采用病毒滴鼻的方法感染動物[12]。流感病毒滴鼻感染小鼠，主要引起肺組織單核細胞浸潤，肺重增加，體重減少[13-15]。因此流感病毒感染的小鼠肺指數(shù)高于正常對照組，說明模型構(gòu)建成功。從宏觀上來看，草血竭純化部分各劑量組可以不同程度地延長小鼠的平均生存時間，對流感感染小鼠具有明確的治療作用。從肺組織的病變上來看，在草血竭純化部分對流感病毒感染小鼠的肺指數(shù)抑制作用研究中，草血竭高、中、低劑量組小鼠的肺指數(shù)均低于病毒對照組，說明草血竭能夠改善流感導致的肺組織病變。從治療機制上來看，草血竭純化部分可降低肺組織流感病毒核酸量和病毒的滴度，提示其治療作用是通過抗病毒實現(xiàn)的。流感病毒感染后，引起感染細胞凋亡，機體炎性細胞因子、趨化因子等活化：外周血中TNF-a、IL-12、IL-18、IFN-a等表達上升，NK細胞等免疫細胞數(shù)目增加，推測草血竭抗流感病毒的機制可能與抑制病毒感染引起的組織細胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫相關(guān)細胞因子表達、增強免疫細胞的生物學功能有關(guān)。此外本研究還提示在降低病死率、改善肺組織損傷、抗病毒方面，草血竭中高劑量和經(jīng)典抗流感病毒藥物奧司他韋的效果基本相當，表明草血竭在對流感病毒感染的治療上具有良好的應(yīng)用前景。

綜上所述，草血竭純化部分在體內(nèi)對甲型H1N1流感病毒具有抑制作用，能夠改善甲型H1N1流感小鼠的肺組織的病變，降低病死率。

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