人源與動(dòng)物源大腸埃希菌的同源性分析

趙 珂, 夏鵬程, 張志軍, 趙書(shū)平

(1泰山醫(yī)學(xué)院, 山東 泰安 271016; 2泰安市中心醫(yī)院, 山東 泰安 271000)

大腸埃希菌是人類和動(dòng)物腸道中的正常定植菌，具有條件致病性和非條件致病性等多樣性特點(diǎn)。在臨床上，大腸埃希菌是最常見(jiàn)的條件致病菌，感染部位廣泛，且耐藥機(jī)制復(fù)雜，在世界范圍內(nèi)廣泛流行[1]。大腸埃希菌也是一類常見(jiàn)的人畜共患病原菌，是動(dòng)物和人類各種疾病中常分離的病原菌[2]。近幾十年來(lái)，隨著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，在病毒性疾病使用有效疫苗加以控制后，大腸埃希菌病原菌可以感染不同生長(zhǎng)階段的鴨，其感染已經(jīng)增加社會(huì)的經(jīng)濟(jì)和健康負(fù)擔(dān)，引起了多次疫情的暴發(fā)與流行[3-6]。全世界普遍關(guān)注的食品安全問(wèn)題中大腸埃希菌感染是一個(gè)主要的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，大腸埃希菌是食品污染監(jiān)測(cè)的主要指標(biāo)菌，近年來(lái)關(guān)于人畜共患大腸埃希菌感染的報(bào)道越來(lái)越多，發(fā)病率增高，流行范圍廣，某些類型病死率高，給養(yǎng)殖業(yè)造成極大損失，而且由此引發(fā)的動(dòng)物源性食品安全問(wèn)題也嚴(yán)重威脅著人類健康[5-6]。本文主要研究大腸埃希菌導(dǎo)致的人畜共患病是否具有同源性。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源 2015年7月—2016年7月從泰安地區(qū)大規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)病鴨肺組織采樣分離到的4株耐多粘菌素非重復(fù)大腸埃希菌，編號(hào)D1、D2、D3、D4；2014年7月—2015年12月在泰安市中心醫(yī)院臨床患者分離的12株耐碳青霉烯類非重復(fù)大腸埃希菌，編號(hào)H1、H2、H3……H12，其中4株來(lái)自重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)患者的尿，3株來(lái)自患者的痰(內(nèi)分泌科、急診科、神經(jīng)外科ICU各1株)，2株來(lái)自ICU患者的血，2株來(lái)自患者的穿刺液(兒外科、普外科東區(qū)各1株)，1株來(lái)自ICU患者的腦脊液；藥敏質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922；脈沖場(chǎng)凝膠電泳參考菌株：沙門菌H9812。

1.2 儀器與試劑 儀器：Microscan WalkAway 96 PLUS型全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析儀(德國(guó)西門子公司)；PCR分析儀、瓊脂糖凝膠電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、CHEF Mapper脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀、Gel Doc成像儀(美國(guó)BIO-Rad公司)。試劑：E-Test條(法國(guó)梅里埃公司，bioMerieux, France)；XbaI[(限制性內(nèi)切酶)Thermo Scientific公司]；藥敏紙片[(10 μg)英國(guó)OXOID公司]；NC61鑒定藥敏板(德國(guó)西門子公司)；SeaKem gold agarose (美國(guó)BD公司)；PCR試劑(上海派森諾生物公司)。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn) 培養(yǎng)方法：按細(xì)菌檢驗(yàn)操作規(guī)程執(zhí)行。鑒定與藥敏：菌株經(jīng)Microscan WalkAway 96 PLUS型全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定 NC50復(fù)合板鑒定和藥敏試驗(yàn)。并根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)修正藥敏結(jié)果。

1.4 耐藥基因比對(duì) 細(xì)菌DNA提取采用煮沸法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增耐藥基因、引物[7]。sunnybio公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性持續(xù)1 min→95℃變性持續(xù)45 s→57℃退火復(fù)性持續(xù)45 s→72℃延伸45 s(需要35個(gè)循環(huán))→72℃延伸10 min結(jié)束。

1.5 多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequenee typing, MLST) 管家基因位點(diǎn)選擇均參照英國(guó)沃里克大學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://mlst.warwick.ac.uk /mlst /dbs /Ecoli)所提供的大腸埃希菌MLST方案(見(jiàn)表1)。選擇管家基因的ST亞型，再將每株菌株的7個(gè)管家基因亞型號(hào)輸入等位基因比對(duì)框，得到每株細(xì)菌的序列分型(ST)號(hào)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果陽(yáng)性者全部送檢測(cè)序；測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST進(jìn)行比對(duì)[8]。

表1大腸埃希菌MLST擴(kuò)增管家基因的引物序列

Table1Primer sequences for MLST amplification of housekeeping genes ofE.coli

管家基因引物(5'→3')片段長(zhǎng)度(bp)退火溫度(℃)adkATTCTGCTTGGCGCTCCGGG 58354CCGTCAACTTTCGCGTATTTfumCTCACAGGTCGCCAGCGCTTC 80654GTACGCAGCGAAAAAGATTC gyrBTCGGCGACACGGATGACGGC 91160GTCCATGTAGGCGTTCAGGGicdATGGAAAGTAAAGTAGTTGTTCCGGCACA 87854GGACGCAGCAGGATCTGTTmdhATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGCTGCTGGCGG 93260TTAACGAACTCCTGCCCCAGAGCGATATCTTTCTTpurACGCGCTGATGAAAGAGATGA81654CATACGGTAAGCCACGCAGA recAACCTTTGTAGCTGTACCACG 78058TCGTCGAAATCTACGGACCGGA

1.6 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE) 將耐藥菌株進(jìn)行接種，18 h后配菌懸液，調(diào)節(jié)菌液濁度至4.5～5.0，1.5 mL的離心管中加入400 μL菌懸液和20 μL蛋白酶 K，然后與56℃預(yù)熱的SeaKemGold Agarose 400 μL混合后注模。將膠塊放入5 mL含25 μL蛋白酶K 的細(xì)胞裂解液中，54℃水浴搖床裂解2 h。將水和TE預(yù)熱于50℃水浴箱中，10～15 mL 50℃的水清洗2次，10～15 mL 50℃的TE清洗3次，每次10～15 min。洗好的膠塊浸于TE，4℃保存。切取膠塊2 mm，浸入含XbaⅠ酶3 μL的200 μL酶切體系中，37℃水浴至少2 h。酶切后的膠塊置于梳齒，Marker位于1、5、10、15泳道，其余泳道放試驗(yàn)菌株。倒入冷卻至50℃ 1%的瓊脂糖，冷卻15 min，放入電泳儀電泳。電泳條件：電壓 6 V，脈沖參數(shù)：初始切換時(shí)間為2.2 s，最終切換時(shí)間為54.4 s，電泳溫度14℃，電泳時(shí)間18 h左右。電泳結(jié)束后取出膠塊，1∶10 000的溴化乙錠溶液染色20～30 min，純水脫色 30 min。用Gel Doc成像[9]。

2 結(jié)果

2.2 耐藥基因比對(duì) 使用通用引物對(duì)耐藥基因進(jìn)行篩選，對(duì)電泳陽(yáng)性的耐藥基因進(jìn)行測(cè)序。人源大腸埃希菌NDM-1均陽(yáng)性，鴨源大腸埃希菌NDM-1均陰性；CTT陽(yáng)性菌株為D1、D2、D3、H3、H10；SHV陽(yáng)性菌株為H7；TEM陽(yáng)性菌株為H3、H5、H10、H11；CTX-M1陽(yáng)性菌株為D4、H4、H8、H9、H10、H11、H12；CTX-M3陽(yáng)性菌株為H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H11、H12；ARMA陽(yáng)性菌株為H6、H8、H9、H11、H12；mcr-1陽(yáng)性菌株為D1、D2、D3、D4。見(jiàn)表3。

表3 鴨源和人源大腸埃希菌耐藥基因比對(duì)

+：陽(yáng)性；-：陰性

2.3 MLST比對(duì)結(jié)果 根據(jù)MLST結(jié)果發(fā)現(xiàn)鴨中D2號(hào)和D3號(hào)ST相同，為5912，鴨中D1號(hào)和臨床分離的H5號(hào)ST相同，為10。見(jiàn)表4。

2.4 PFGE 將ST相同的鴨源大腸埃希菌和臨床患者分離的大腸埃希菌2株編號(hào)，進(jìn)行PFGE；沙門Braenderup血清型H9812作為參考菌株，經(jīng)XbaI酶切作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，即Marker。大腸埃希菌經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切后的PFGE圖，將PFGE圖譜，輸入Bionumeric軟件聚類分析，2株菌株相似度為64.7%。見(jiàn)圖1。

表4 鴨源和人源大腸埃希菌MLST比對(duì)結(jié)果

圖1 D1和H5大腸埃希菌PFGE電泳聚類分析圖

3 討論

MLST和PFGE是近年發(fā)展起來(lái)的基于分子水平的分型技術(shù)。MLST技術(shù)是建立在管家基因測(cè)序基礎(chǔ)上的分型技術(shù)，通過(guò)分析多個(gè)管家基因位點(diǎn)的核酸序列獲得等位基因編碼和ST型。PFGE在細(xì)菌分型上得以應(yīng)用，以其分辨力強(qiáng)、重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定、易于標(biāo)準(zhǔn)化、鑒別力高而被譽(yù)為細(xì)菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[14]，并且廣泛應(yīng)用于眾多細(xì)菌的分子流行病學(xué)調(diào)查，分析菌株的相關(guān)性，描述感染的傳播途徑并追蹤溯源[15-17]。本次研究發(fā)現(xiàn)人源5號(hào)和鴨源1號(hào)大腸埃希菌ST相同，為ST10，與Xu Y等[8]報(bào)道的在腹瀉患者、健康攜帶者、動(dòng)物和生肉中分離到的大腸埃希菌ST相同。也有文獻(xiàn)[18-20]表明畜禽中廣泛流行的序列型ST10及其復(fù)合體在本地區(qū)居民中多見(jiàn)，可初步證明耐藥性有從畜禽向人類傳播的趨勢(shì)。其他鴨源中2株ST5912，1株ST156，臨床分離的大腸埃希菌分別為1株ST405，1株ST1193，1株ST5703，1株ST167。 我們進(jìn)而對(duì)來(lái)源不同但ST相同的大腸埃希菌進(jìn)行PFGE，發(fā)現(xiàn)分為不同譜型，PFGE帶型相似度只有64.7%，以往報(bào)道中也出現(xiàn)過(guò)這種現(xiàn)象。原因可能是MLST方法是選用序列具有高度保守性的管家基因進(jìn)行序列分析，造成其可能對(duì)同一血清型別的菌株的分型能力較弱，劉慧玲等[15]研究表明， 對(duì)于同一血清型的菌株，PFGE分辨力更高?？傊?，PFGE的分型能力高于MLST，MLST結(jié)果與血清型相關(guān)性較高[21]。我們?nèi)孕枰獢U(kuò)大標(biāo)本量進(jìn)行更全面的研究。

雖然本研究結(jié)果表明泰安地區(qū)人源與鴨源大腸埃希菌同源性并不是很高；但是，大腸埃希菌具有很高的人畜共患潛力，對(duì)公眾構(gòu)成重大健康威脅。越來(lái)越多的證據(jù)表明，大部分亞洲人群具有人畜共患潛力，致病性大腸埃希菌向人類傳播的途徑是通過(guò)消費(fèi)動(dòng)物來(lái)源的食物，特別是零售家禽產(chǎn)品傳播[3]。我們?nèi)詰?yīng)重視，對(duì)人畜共患大腸埃希菌病防治應(yīng)根據(jù)其流行特征，一方面要選用敏感藥物，合理使用抗菌藥物，從而防止產(chǎn)生多重耐藥大腸埃希菌；另一方面要提高群眾的防病意識(shí)，注重養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生。預(yù)防為主、人病畜防、建立健全人畜共患病防控體系，變被動(dòng)應(yīng)付為主動(dòng)預(yù)防，把人畜共患病的危害降到最低，必須增強(qiáng)以人為本的理念，建立健全科學(xué)有效的人畜共患病防控體制和機(jī)制。

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