分子檢測與常規(guī)培養(yǎng)在中重度皮膚軟組織感染病原學(xué)診斷中的比較

謝 昆, 李湘燕, 朱賽楠, 齊 心, 鄭 波

(北京大學(xué)第一醫(yī)院，北京 100034)

中重度皮膚軟組織感染(skin and soft tissue infection,SSTI)早期使用敏感抗菌藥物，對控制病情、縮短病程都有重要的臨床意義[1]。目前SSTI治療方案的制定主要根據(jù)常規(guī)細菌培養(yǎng)結(jié)果，但是常規(guī)培養(yǎng)結(jié)果相對滯后、陽性率低，導(dǎo)致患者可能錯失抗感染治療的黃金時期，因此，病原學(xué)的早期診斷，對實現(xiàn)早期抗菌藥物目標(biāo)性治療，改善患者預(yù)后有重要意義[2]。分子診斷技術(shù)是應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)而做出診斷的技術(shù)，檢測靶標(biāo)包括DNA、RNA，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要前沿領(lǐng)域之一。分子診斷技術(shù)的主要手段包括聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)、基因芯片技術(shù)及DNA測序等。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction, PCR)作為分子生物學(xué)方法中一種常用的方法，以其敏感、特異、簡便、快速的特點，可用于感染早期快速檢測，并明確病原體[3]。然而目前分子病原學(xué)診斷多用于創(chuàng)面分泌物的檢測，缺乏SSTI病變組織的研究。本研究旨在評估中重度SSTI組織樣本中分子生物學(xué)檢測方法的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 按照連續(xù)采樣方法，收集2016年1—10月北京大學(xué)第一醫(yī)院整形燒傷外科收治的中重度SSTI病例。入組標(biāo)準：符合美國感染病學(xué)會(Infectious Diseases Society of America)中重度SSTI的分級標(biāo)準[4]。入組患者50例，其中糖尿病足并感染患者22例，手術(shù)部位感染患者15例，膿腫患者8例，壞死性筋膜炎患者5例。

1.2 標(biāo)本留取及處理 創(chuàng)面徹底清創(chuàng)后，使用4 mm 環(huán)鉆取深部組織共3塊，加入30 mL生理鹽水，研磨后，制成懸濁液后平均分為3份。第1份注入帶有培養(yǎng)基的需氧及厭氧培養(yǎng)瓶內(nèi)，常規(guī)細菌培養(yǎng)。第2份行細菌涂片檢查，細菌涂片及培養(yǎng)由北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科細菌室完成。第3份使用DNA提取試劑盒提取DNA。

1.3 主要試劑及儀器 細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)購自天根生化科技(北京)有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；TaKaRa Taq Hot Start Version、2.5 mmol dNTP Mixture、10×PCR Buffer均購自寶生物工程(大連)有限公司；親和素堿性磷酸酶購自Vector公司；牛血清白蛋白、BCIP、NBT購自Amresco公司；Biotin-11-dUTP購自紅惠新醫(yī)藥公司；其他生化試劑購自北京化工廠；硝酸纖維素膜購自GE公司。PCR儀為美國賽默飛世爾公司的ABI 9700 I 型PCR儀；AH-8100生物芯片雜交儀、AH-8200生物芯片雜交儀、AA-9100生物芯片分析儀為和利時公司產(chǎn)品。

1.4 引物設(shè)計 以金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、屎腸球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌等九種常見細菌基因組保守區(qū)為靶序列，自行設(shè)計特異性引物及試劑盒，對標(biāo)本的DNA行PCR檢測，引物序列見表1。

1.5 分子檢測 PCR擴增：PCR反應(yīng)體系1為：1×PCR Buffer，2 μmol dNTP，4 μmol Biotin-11-dUTP，2 mmol MgCl2，金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、屎腸球菌、糞腸球菌上下游引物各400 nmol ，2 U Taq酶，0.4 U JNG酶，模板2 μL，水加至60 μL；PCR反應(yīng)體系2為：1×PCR Buffer，2 μmol dNTP，4 μmol Biotin-11-dUTP，2 mmol MgCl2，大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌上下游引物各400 nmol ，2 U Taq酶，0.4 U JNG酶，模板2 μL，水加至60 μL。反應(yīng)條件：37℃消化10 min；94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個循環(huán)；72℃延伸10 min。 探針標(biāo)記及雜交：將9條特異性探針標(biāo)記于硝酸纖維素膜上，每條探針標(biāo)記3個點。將PCR擴增后的反應(yīng)管置于PCR擴增儀中99℃，10 min，然后快速置于冰水浴中。設(shè)置雜交程序按照儀器說明書[5]。將雜交反應(yīng)后的芯片放入生物芯片分析儀中進行數(shù)據(jù)分析，判讀結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，采用描述性統(tǒng)計方法。

2 結(jié)果

2.1 革蘭染色結(jié)果 革蘭染色方法陽性率為16.0%(8/50)，其中革蘭陽性球菌4份，革蘭陰性桿菌1份，陰性桿菌合并陽性球菌2份，陰性桿菌合并陽性桿菌1份。

表1 各菌種的特異性引物序列及特異性探針序列

2.2 常規(guī)細菌培養(yǎng)與分子生物學(xué)檢測結(jié)果 常規(guī)細菌培養(yǎng)方法陽性率為76.0%(38/50)，其中單一菌種35份，多菌種3份，分別為大腸埃希菌合并糞腸球菌2份，金黃色葡萄球菌合并糞腸球菌1份。其中有2份培養(yǎng)陽性標(biāo)本考慮為非致病菌，菌種分別為藤黃微球菌及痤瘡丙酸桿菌。分子檢測陽性率56.0%(28/50)，單一菌種22份，多菌種6份。詳見表2、表3。

表2 常規(guī)培養(yǎng)與分子生物學(xué)檢測結(jié)果(n=50)

表3常規(guī)培養(yǎng)及分子檢測結(jié)果菌種分布(株)

Table3Distribution of strain species of routine culture and molecular detection results (No. of isolates)

細菌常規(guī)培養(yǎng)分子檢測金黃色葡萄球菌1014大腸埃希菌46表皮葡萄球菌42糞腸球菌45銅綠假單胞菌34陰溝腸桿菌33肺炎克雷伯菌22白假絲酵母菌3-變形桿菌屬3-鏈球菌屬2-雷丁放線菌1-藤黃微球菌1-痤瘡丙酸桿菌1-合計4136

2.3 培養(yǎng)法和分子檢測法檢測結(jié)果比較 除去常規(guī)培養(yǎng)結(jié)果不在選取的9種細菌范圍內(nèi)的標(biāo)本11份，納入統(tǒng)計的共 39份標(biāo)本。其中細菌涂片陽性者8份，陽性率為20.5%；常規(guī)培養(yǎng)及分子檢測結(jié)果陽性率均為69.2 %(27/39)。常規(guī)培養(yǎng)及分子檢測結(jié)果完全符合率為82.1%(32/39)：二者結(jié)果均為陰性占25.6%(10/39)；二者結(jié)果均為陽性且完全符合占56.4%(22/39)。常規(guī)培養(yǎng)及分子檢測結(jié)果不符合率為17.9%(7/39)，分子檢測結(jié)果為多種細菌，而培養(yǎng)結(jié)果為單一細菌者占7.7%(3/39)；分子檢測結(jié)果為陽性而培養(yǎng)結(jié)果為陰性者占5.1%(2/39)。詳見表4。

表4常規(guī)培養(yǎng)法和分子檢測法結(jié)果比較(份)

Table4Comparison of routine culture and molecular detection results (No. of specimens)

檢測結(jié)果常規(guī)培養(yǎng)分子檢測符合單一菌種 金黃色葡萄球菌9109 肺炎克雷伯菌222 大腸埃希菌232 銅綠假單胞菌322 糞腸球菌111 陰溝腸桿菌311 表皮葡萄球菌422多菌種 大腸埃希菌+糞腸球菌222 金黃色葡萄球菌+糞腸球菌111 銅綠假單胞菌+金黃色葡萄球菌010 金黃色葡萄球菌+陰溝腸桿菌+糞腸球菌010 銅綠假單胞菌+陰溝腸桿菌+大腸埃希菌010合計272722

3 討論

中重度SSTI，尤其是有膿毒癥的患者，早期使用敏感的抗菌藥物控制感染，對控制病情、縮短病程都有重要的臨床意義[6]。早期病原學(xué)的診斷有助于在感染早期實現(xiàn)目標(biāo)性治療，避免抗菌藥物的濫用，以達到進行個性化精準治療的目的[7-8]。分子檢測技術(shù)可以通過在分子生物學(xué)水平上研究生物大分子，特別是核酸結(jié)構(gòu)及其組成部分檢測無法培養(yǎng)或難以鑒定的病原性微生物[9-10]。對于單一致病菌導(dǎo)致的感染檢測有著非常好的效果，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于HIV、HCV等多種病毒感染以及衣原體及分枝桿菌感染的檢測中[11-13]。目前已有報道稱多重PCR-基因芯片雜交技術(shù)可用于耐藥菌感染的病原學(xué)早期診斷和耐藥基因的同步檢測[14-15]。但目前尚無分子診斷方法用于中重度SSTI的快速檢測產(chǎn)品問世，急需開展相關(guān)研究。

根據(jù)我院近5年來軟組織感染的細菌譜，并結(jié)合其他學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、屎腸球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌等9種細菌是臨床軟組織感染最常見的病原體，合計占全部病原體的90%以上[16]。故我們在實驗中選取這9種細菌，展開相關(guān)分子病原學(xué)研究。我們選取的50例患者中，常規(guī)培養(yǎng)陽性共38例，而這9種細菌共27例，僅占71.1%，說明這9種細菌雖然可以覆蓋大部分的常見致病菌，但仍存在覆蓋不足的問題，后期研究應(yīng)擴大分子病原學(xué)研究的菌種范圍。

涂片的敏感性較低，低于常規(guī)培養(yǎng)及分子檢測，不宜作為早期病原體鑒定的可靠檢查方法，僅可以作為補充檢測手段。雖然目前常規(guī)培養(yǎng)是感染診斷的金標(biāo)準，但其本身仍具有很大的缺陷，包括標(biāo)本采集情況、培養(yǎng)條件的選擇及不同種細菌直接的互相影響等，并不總能真實的反映感染病原體的情況。在實驗中為了提高陽性率，雖然我們采用了取組織塊研磨培養(yǎng)等方法，但是總體的培養(yǎng)陽性率并不高，僅為76.0%，可能還需要進一步改善取材方法及檢驗方法。最終入組進行對比研究的39例患者中，分子檢測與常規(guī)培養(yǎng)的陽性率大致相當(dāng)，二者的完全符合率為82.1%，具有較高的符合程度。部分符合率7.7%，均為分子檢測結(jié)果為多種細菌感染，而培養(yǎng)結(jié)果僅為單一細菌，說明對于復(fù)雜的復(fù)合菌感染的病原學(xué)診斷，分子檢測手段具有一定的優(yōu)勢。

比較實驗中常規(guī)培養(yǎng)及分子檢測兩種檢測方法結(jié)果的差異，主要有三類情況：首先，分子檢測結(jié)果為多種細菌感染，而培養(yǎng)結(jié)果僅為單一細菌者 3 例。其原因可能為在復(fù)合菌感染的情況下，常規(guī)培養(yǎng)時，不同細菌相互之間有抑制作用，不能形成優(yōu)勢菌群生長，而分子檢測并不受這種因素的影響，只要標(biāo)本中存在細菌核酸，即能檢測出對應(yīng)細菌。其次，分子檢測結(jié)果為陽性而培養(yǎng)結(jié)果為陰性者 2 例，細菌分別為大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌，以上兩種差異體現(xiàn)了分子檢測方法對常見致病菌和復(fù)合菌感染敏感性高于普通細菌培養(yǎng)。第三，分子檢測結(jié)果為陰性而培養(yǎng)結(jié)果為陽性者 2 例，細菌均為表皮葡萄球菌，因為表皮葡萄球菌為正常定植菌，廣泛存在于自然界中，不除外取材或轉(zhuǎn)移過程中有污染可能，從而導(dǎo)致的假陽性出現(xiàn)，但也不能除外是由本研究中分子檢測手段的缺陷導(dǎo)致的假陰性可能，需要增加樣本量后進一步評估。

綜上所述，本研究顯示分子檢測技術(shù)與常規(guī)培養(yǎng)等方法相比較具有很高的一致性，在復(fù)合菌感染檢出方面有一定的優(yōu)勢。

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