夫西地酸有關物質的色譜-質譜結構鑒定

梁方梅，倪悅泠，王 璐，杭太俊，宋 敏

(中國藥科大學藥物分析系，南京 210009)

夫西地酸(fusidic acid,圖1)，即16β-乙酰氧基-3α,11α-二羥基-4α,8α,14β-三甲基-18-去甲-5α,10β-膽甾-(17Z)-17(20),24-二烯-21-酸，是一種具有甾體骨架的抗生素，對葡萄球菌等多種革蘭陽性菌有較強的抗菌作用[1-4]。夫西地酸通過抑制核糖體的易位來延長干擾因子G,阻礙細菌蛋白質的合成，此種獨特的抗菌機制是夫西地酸與其他抗生素無交叉耐藥性的原因[4-5]。夫西地酸的質量控制研究已有文獻報道[6-11],歐洲藥典(9.0版)(EP9.0)和英國藥典(2017版)已收載其質量標準。但關于夫西地酸有關物質的系統(tǒng)研究與鑒定未見報道。

Figure1 Chemical structure of fusidic acid

本研究建立了適用于夫西地酸有關物質檢查的色譜-質譜聯(lián)用分析方法，通過TOF/MS測定了夫西地酸有關物質的精密相對分子質量及分子式，結合MS/MS的子離子特征，綜合解析鑒定其有關物質的結構，為夫西地酸的存儲條件和質量控制提供了參考依據(jù)。

1 材 料

1.1 試 劑

夫西地酸原料藥(批號170910FA，江蘇九陽生物制藥有限公司)；夫西地酸各有關物質對照品(EP9.0雜質A、B、C、D、F、G、H、I、K、L、M，美國CATO Research Chemicals公司)。甲酸(分析純，南京化學試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Tedia公司)；水(市售純凈水)。

1.2 儀 器

Agilent 1260 Infinity液相色譜-6224飛行時間質譜儀(美國Agilent公司)；Thermo Dionex UltiMate 3000高效液相色譜-TSQ Quantum Ultra型LC-MS/MS聯(lián)用儀(美國Thermo-Fisher公司)；BS 21S分析天平(德國Sartorius公司)。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Extend-C18(150 mm × 4.6 mm，3.5 μm)；流動相A為甲醇-乙腈-水-甲酸(20∶40∶40∶0.05)，流動相為B甲醇-乙腈-水-甲酸(20∶70∶10∶0.04)，進行線性梯度洗脫(A∶B):0 min(100∶0)→28 min(0∶100)→33 min(0∶100)→33.1 min (100∶0)→38 min(100∶0)，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長為235 nm。進樣量40 μL。分流比7∶3進行MS檢測。

2.2 質譜條件[12]

電噴霧正離子化，TOF/MS測定噴霧電壓3.5 kV，霧化氮氣壓力275 kPa，流量10 L/min，溫度350 ℃，碎片電壓200 V，參比離子m/z121.050 8(質子化嘌呤，C5H5N4+)和m/z922.009 8(質子化氟代膦嗪HP-921，C18H19O6N3P3F24+)，掃描范圍m/z100～1 000。MS/MS測定的噴霧電壓4 kV，霧化氣壓力300 kPa，輔助氣壓力35 kPa，毛細管溫度350 ℃，二級質譜掃描碰撞氬氣壓力0.16 Pa，碰撞能量10～35 eV。

2.3 溶液配制

2.3.1 供試品溶液 取夫西地酸約25 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加稀釋劑(甲醇-乙腈-水，10∶50∶40)溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質量濃度為2.5 mg/mL的供試品溶液。精密量取上述溶液適量，加稀釋劑定量稀釋，配制0.1%的自身對照溶液。

2.3.2 對照品溶液 取各有關物質對照品適量，精密稱定，加稀釋劑溶解并定量稀釋成質量濃度均約為2.5 μg/mL的溶液作為混合雜質對照溶液。

2.3.3 強制降解試驗溶液 取夫西地酸各約25 mg，分別經(jīng)2 mol/L 鹽酸溶液1 mL 60 ℃水浴12 h,1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL室溫放置1.5 h,5%過氧化氫2 mL 60 ℃水浴3 h，稀釋劑2 mL 90 ℃水浴6 h，或光照(4 500 lx)5 d，分別處理，然后加稀釋劑溶解(酸堿處理溶液先中和)并稀釋至10 mL，配制成質量濃度約為2.5 mg/mL的強制降解試驗溶液。同時進行空白試驗溶液。

3 結 果

3.1 有關物質檢查

建立的夫西地酸有關物質揮發(fā)性流動相HPLC檢查方法適用于質譜聯(lián)用鑒定。圖2為夫西地酸及其酸強制降解溶液的DAD-TIC譜圖。圖3為夫西地酸及其有關物質HPLC檢查的典型色譜圖。按保留時間由小到大順序編號，共檢出分離效果良好的19個主要有關物質。

夫西地酸供試品共檢出5個有關物質，為有關物質11、13、14、17、19(圖2-c～d)；采用0.1%自身對照法估算有關物質含量,僅有關物質19的含量大于 0.1%(圖3-b)。強制降解試驗結果表明，本品在強酸、強堿、氧化、高溫和光照條件下均不穩(wěn)定。酸破壞形成4個主要降解產(chǎn)物(圖3-c，有關物質10、12、17和18)；堿破壞形成1個主要降解產(chǎn)物(圖3-d，有關物質17)；氧化破壞形成8個主要降解產(chǎn)物(圖3-e，有關物質1～6、8和9)；光照破壞形成5個主要降解產(chǎn)物(圖3-f，有關物質4、6、8、9和11)；高溫破壞形成4個主要降解產(chǎn)物(圖3-g，有關物質14～17)。

Figure2 LC-MS chromatograms of fusidic acid and its typical stress solutions

a:DAD chromatograms of acid stress solutions;b:TIC chromatograms of acid stress solutions;c:DAD chromatograms of active pharmaceutical ingredient (API);d:TIC chromatograms of API

Figure3 HPLC-UV chromatograms of fusidic acid and its stress solutions

a:0.1% Reference solution;b:API;c:Acid;d:Alkaline;e:Oxidation;f:Photolysis;g:Thermal;h:Mixture of reference RSs (A-M)

3.2 有關物質的結構鑒定

采用LC-MS測得各有關物質母離子的準確相對分子質量和離子組成，以及它們的二級質譜特征碎片，并通過與夫西地酸和已知有關物質的質譜特征的對比分析，鑒定各主要有關物質的結構。結果見表1和圖4。

Table1 Structures of the related substances (RSs) identified by LC-MS of fusidic acid

RS(EP 9.0 impurity)[M+H]+/ [M+NH4]+ (m/z)tR/minIon formulaDif.Product ion(m/z)Origins1(A)568.382 84.3/4.5C31H50O8NH4+2.87491,473,455,437,429Dr2584.377 04.7C31H50O9NH4+3.95507,489,471,281Dr3584.377 35.1C31H50O9NH4+3.60507,489,471,281Dr4(B)550.372 65.9C31H48O7NH4+2.31473,455,437,261,247Dr5(C)550.372 76.7C31H48O7NH4+2.07473,455,437,261,247Dr6(D)550.373 27.2C31H48O7NH4+1.17473,455,437,261,247Dr7(F)548.359 67.5C31H46O7NH4+2.74489,471,453,435,417,351-8550.374 17.7C31H48O7NH4+-0.62473,455,437,261,247Dr9550.374 38.0C31H48O7NH4+-0.93473,455,437,261,247Dr10534.376 99.1C31H48O6NH4+3.89475,457,439,421,393Dr11(G)532.361 99.9C31H46O6NH4+2.53455,437,263Dr,Pr 12457.331 610.0C29H44O4H+0.59439,421,393,351,299,281Dr13(H)532.362 110.3C31H46O6NH4+2.23455,437,263Dr,Pr14(I)475.341 911.8C29H46O5H+-0.19457,439,421,263Dr,PrAPI534.378 612.4C31H48O6NH4+0.63475,457,439,421,263API15489.356 613.8C30H48O5H+2.88457,439,421,263Dr16457.331 115.3C29H44O4H+0.22439,421,393,351,297,279,263,217,199,95Dr17(K)457.331 115.8C29H44O4H+0.26439,421,393,351,297,279,263Dr,Pr18(L)516.367 816.8C31H46O5NH4+1.16439Dr19(M)518.382 819.7C31H48O5NH4+2.39441Pr

Pr:Process related substance;Dr:Degradation product

Figure4 Chemical structures of the related substances (RS1-19) of fusidic acid

3.2.1 已知有關物質的確證 通過有關物質HPLC定位及質譜定性，確證有關物質1、4、5、6、7、11、13、14、17、18和19分別與EP9.0規(guī)定的已知有關物質A、B、C、D、F、G、H、I、K、L和M對應。對夫西地酸和各已知有關物質的一級質譜母離子準確相對分子質量、二級質譜特征碎片離子和裂解途徑(圖5和圖6)分析，可以輔助其未知有關物質結構的推斷與鑒定。

夫西地酸及已知有關物質裂解規(guī)律如下：

①夫西地酸及有關物質7、11、13、18和19的母離子(P+)中，16位的酯鍵易斷裂為羥基，進一步與21位的羧基縮合成五元環(huán)內(nèi)酯，生成相對分子質量為[P-77]+的特征碎片離子。

②有關物質14的母離子(P+)中，16位的羥基與21位的羧基縮合成五元環(huán)內(nèi)酯，生成相對分子質量為[P-18]+的特征碎片離子。

③有關物質1、4、5、6的母離子(P+)中，24或25位的羥基易和21位的羧基縮合成六元環(huán)內(nèi)酯，16位酯鍵易斷裂為羥基，同時結構中的羥基脫水，生成相對分子質量為[P-77]+/[P-95]+/[P-113]+/[P-131]+的一系列特征碎片離子。

④夫西地酸及其有關物質常會甾體環(huán)斷裂，產(chǎn)生281、279、263、265、253、217、199、189、177、175、159、145、119、95等碎片離子峰簇，盡管結構不同可能導致占主導地位的碎片離子峰不同，但碰撞電壓的不同也可能會導致以上碎片離子峰簇的豐度此消彼長，因此，此類碎片離子只宜用于驗證結構推斷的正確性，而不能作為判定某基團存在的決定性依據(jù)。

Figure5 MS/MS spectra of fusidic acid and its impurity reference substance API (m/z534),1(m/z568),4-6(m/z548),11and13(m/z532),14(m/z475),17(m/z457),18(m/z516),19(m/z518)

Figure6 MS/MS fragmentation pathways of the product mass spectra of [M+H]+or [M+NH4]+ions of fusidic acid and its typical RSs

3.2.2 未知有關物質的確證 通過有關物質HPLC定位及質譜特征，結合夫西地酸和已知有關物質裂解規(guī)律，對各未知有關物質進行綜合分析鑒定其結構。

有關物質2和3：ESI+-TOF/MS測得有關物質2和3的[M+NH4]+的準確相對分子質量分別為584.377 0和584.377 3，均與離子式C31H50O9NH4+相應，二者為同分異構體；其相對分子質量比有關物質1多16，與一個O原子相應。MS/MS主要特征碎片離子m/z489、471與有關物質1一致，均含有[P-77]+/[P-95]+碎片離子，故有關物質2和3是夫西地酸的三羥基化的同分異構產(chǎn)物。并且在氧化降解樣品的m/z584.379 3提取離子流色譜圖中顯示有5個三羥基化異構體 (圖7)，這與夫西地酸結構中存在兩個烯鍵，且烯鍵及其α位均可發(fā)生氧化反應的特征相應。因結構中有多個手性碳，故推斷有關物質2和3(圖7)為夫西地酸三羥基化的非對映異構體產(chǎn)物。有關物質2以圖7中化合物b為例進行解析，質譜裂解(圖8)均得到合理歸屬。

Figure7 Extracted ion chromatogram ofm/z584.379 3 and inferred structures

Figure8 MS/MS spectrum and fragmentation pathways of the product mass spectrum of [M+NH4]+ions of RS2

有關物質8和9：ESI+-TOF/MS測得有關物質8與9的[M+NH4]+的準確相對分子質量分別為550.374 1和550.374 3，均與離子式C31H48O7NH4+相應，與有關物質4、5、6互為同分異構體；其相對分子質量比夫西地酸多16，與一個O原子相應。MS/MS主要特征碎片離子為m/z473、455、437、261、247，其中m/z473比夫西地酸的特征碎片m/z455多16，推斷有關物質8和9為夫西地酸單羥基化的同分異構產(chǎn)物，并且在氧化降解樣品的m/z550.378 4提取離子流色譜圖中顯示有多個單羥基化異構體 (圖9)，這與夫西地酸結構中存在兩個烯鍵，且烯鍵及其α位均可發(fā)生氧化反應的特征相應。如26、27位被氧化形成一對順反異構體[圖9中化合物a(EP9.0雜質E)和化合物b]，22或23位被氧化形成兩對對映異構體(圖9中化合物d和e)，24位烯鍵可被氧化為酮(圖9中化合物c)。有關物質8以圖9中化合物a為例進行解析，質譜裂解(圖10)均得到合理歸屬。

Figure9 Extracted ion chromatogram ofm/z550.378 4 and inferred structures

Figure10 MS/MS spectrum and fragmentation pathways of the product mass spectrum of [M+NH4]+ions of RS8

有關物質10：ESI+-TOF/MS測得有關物質10的[M+NH4]+的準確相對分子質量為534.376 9，與離子式C31H48O6NH4+相應；相對分子質量與元素組成和夫西地酸一致，為夫西地酸異構體。MS/MS主要特征碎片離子為m/z475、457、439、421、393，豐度較高的特征碎片離子439與有關物質18相同，推測其與有關物質18有相同的母核結構。在m/z534.378 9的提取離子流色譜圖中顯示1個夫西地酸異構體色譜峰(圖11)，即有關物質10。強制降解實驗結果表明,有關物質10和18主要在酸破壞條件下產(chǎn)生，根據(jù)化學反應規(guī)律并參考裂解規(guī)律，推斷夫西地酸在酸條件下11位羥基脫水，同時 24位烯鍵與水加成(根據(jù)馬氏規(guī)則，羥基加在25位C)生成有關物質10。有關物質10的碎片經(jīng)合理途徑產(chǎn)生(圖12)。

Figure11 Extracted ion chromatogram ofm/z534.378 9 of RS10

有關物質12和16：ESI+-TOF/MS測得有關物質12、16的[M+H]+的準確相對分子質量分別為457.331 6、457.331 1，均與離子式C29H44O4H+相應，與有關物質17互為同分異構體。比夫西地酸相對分子質量少60，元素組成少C2H4O2，與一分子H2O和乙酰基相應。有關物質12、16和17二級均需較高的碰撞能量，產(chǎn)生很多甾體環(huán)裂解碎片離子峰。在酸和高溫破壞樣品中提取離子流m/z457.331 2的色譜圖中，顯示共有5個異構體色譜峰(圖13)，其中Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ分別為有關物質12、16和17。有關物質16的MS/MS主要特征碎片離子與已知有關物質17一致，結合二者色譜保留和極性相近特征，推斷有關物質16[圖13中化合物c(EP9.0雜質J)]是有關物質17的非對映異構體。有關物質12極性較大，故推斷其含有游離羥基和羧基，這與其MS/MS特征碎片離子m/z439豐度較高相應，故推斷有關物質12為夫西地酸3位或11位羥基脫水且16位酯鍵水解的降解產(chǎn)物(圖13中化合物a和b)。有關物質12以圖13中化合物b為例進行解析，質譜裂解(圖14)均得到合理歸屬。

Figure12 MS/MS spectrum and fragmentation pathways of the product mass spectrum of[M+NH4]+ions of RS10

Figure13 Extracted ion chromatogram ofm/z457.331 2 and inferred structures

Figure14 MS/MS spectra of RS12,16and fragmentation pathways of the product mass spectrum of [M+H]+ions of RS12

有關物質15：ESI+-TOF/MS測得有關物質15[M+H]+的準確相對分子質量為489.356 6，與離子式C30H48O5H+相應；比夫西地酸相對分子質量少28，元素組成少CO，與一分子C=O相應。在高溫降解樣品的m/z489.357 5的提取離子流色譜圖中顯示3個異構體色譜峰(圖15)，這與夫西地酸羧基斷裂，且烯鍵可發(fā)生氧化反應的特征相應。如夫西地酸21位脫羧酸，同時17或24位烯鍵被氧化為羰基的異構體產(chǎn)物(圖15中化合物a和b)；或碳正離子發(fā)生重排,26或27位被羰基化形成一對非對映異構體(圖15中化合物c)。有關物質15的主要碎片離子m/z457，與支鏈末端脫去一分子CH3OH相應，因此推斷有關物質15為夫西地酸24位雙鍵羰基化產(chǎn)物(圖15中化合物b或c)。有關物質15以圖15中化合物b為例進行解析，質譜裂解(圖16)均得到合理解析。

Figure15 Extracted ion chromatogram ofm/z489.357 5 and inferred structures

Figure16 MS/MS spectrum and fragmentation pathways of the product mass spectrum of [M+H]+ions of RS15

Figure17 Schematic representation of main RSs of fusidic acid and the stress conditions

4 討 論

在建立的揮發(fā)性流動相色譜-質譜聯(lián)用鑒定條件下，夫西地酸與各有關物質均得到有效的分離，共檢測到19個有關物質；其中11個為已知有關物質(1、4、5、6、7、11、13、14、17、18和19),8個為未知有關物質。且已知雜質的洗脫順序、夫西地酸供試品檢出的雜質及強制降解產(chǎn)生的雜質個數(shù)與EP9.0規(guī)定的非揮發(fā)性色譜條件結果一致。

夫西地酸有關物質的相關性與降解途徑見圖17。強制降解實驗結果表明，夫西地酸降解產(chǎn)物可分為3類。第1類為在酸、堿或高溫條件下，導致夫西地酸結構中酯鍵水解形成的產(chǎn)物，包括有關物質14、15、16和17；第2類為在氧化或光照條件下結構中烯鍵及其α位發(fā)生氧化反應形成的產(chǎn)物，包括有關物質1、2、3、4、5、6、8、9和11。第3類為在強酸條件下結構中不同位點羥基脫水或酯鍵水解形成的產(chǎn)物，包括有關物質10、12和18。因此，夫西地酸應避光、陰涼暗處密閉存儲。

本研究通過色譜-質譜聯(lián)用技術對夫西地酸有關物質的分析研究，對其降解途徑進行了探討，為其存儲條件和質量研究提供了參考依據(jù)。

參 考 文 獻

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