防風(fēng)薄層色譜指紋圖譜的建立及其方法學(xué)研究

廖華麗,丁冬梅,李 清

(1廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校藥學(xué)系,廣州 510663;2沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院;*

防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.的干燥塊根[1]。防風(fēng)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為草部上品[2]?！吨袊幍洹?015年版收載的正品防風(fēng),習(xí)稱關(guān)防風(fēng)或北防風(fēng),產(chǎn)地主要是黑龍江、內(nèi)蒙古、吉林、遼寧、河北、山東等省區(qū)[3],具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙的功能,主治感冒頭痛、風(fēng)濕麻痹、風(fēng)疹瘙癢、破傷風(fēng)[1]。防風(fēng)作為大宗藥材,臨床應(yīng)用安全有效,在眾多中藥復(fù)方制劑中發(fā)揮重要作用,例如,防風(fēng)通圣丸[4]、玉屏風(fēng)散[5]、痛瀉要方[6]等。然而,由于防風(fēng)存在的歷史悠久,防風(fēng)引種情況普遍,故而產(chǎn)地多,加之各地習(xí)用品眾多,同名異物普遍存在,例如云防風(fēng)[7]、水防風(fēng)[8]、川防風(fēng)、西北防風(fēng)[9],它們?cè)诨瘜W(xué)組成上有一定的差別[10],給臨床用藥的安全有效造成障礙。為此,已有文獻(xiàn)報(bào)道它們的薄層色譜鑒別,但因沒有化學(xué)對(duì)照品[11]、僅用兩個(gè)成分作對(duì)照[1,12]或者所得到的色譜條帶不夠多,指紋性不強(qiáng)[13],難以達(dá)到準(zhǔn)確鑒別的目的。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用對(duì)照藥材和五個(gè)成分的化學(xué)對(duì)照品,采用高效薄層色譜,可達(dá)到準(zhǔn)確鑒別的目的,為防風(fēng)藥材的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ZF-1三用紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)、數(shù)碼相機(jī)(佳能)、TDZ4-WS低速臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)、BP210S電子天平(德國Satorius公司)、KH200B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)、HPX-16085H-3恒溫恒濕箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)、AB135-S十萬分之一天平(METTLER TOLED儀器有限公司)。

1.2 試藥

甲醇、乙醇、甲酸、環(huán)己烷、乙酸乙酯、無水乙醇、硫酸、二氯甲烷均為分析純,硅膠G預(yù)制板TLC、HPTLC(山東青島海洋),硅膠G預(yù)制板(德國默克公司),以上薄層板均為20 cm×10 cm規(guī)格。升麻素苷(純度93.9%)、5-O-甲基維斯阿米醇葡萄糖苷(純度96.4%)、升麻素(純度>98%)、亥茅酚苷(純度>98%)、防風(fēng)對(duì)照藥材,以上對(duì)照品均購自中國藥品生物制品檢定所,紫花前胡苷(純度>98%)購自成都曼斯特生物科技有限公司。

1.3 藥材

本研究收集了不同產(chǎn)地的防風(fēng)共15批,經(jīng)沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院賈英教授鑒定為防風(fēng)科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.的干燥塊根。樣品1-3號(hào)產(chǎn)地是內(nèi)蒙古,4-6號(hào)產(chǎn)地是黑龍江,7,8號(hào)產(chǎn)地是遼寧,9-11號(hào)產(chǎn)地是吉林,12,13號(hào)產(chǎn)地是河北,14號(hào)產(chǎn)地是安徽,15號(hào)產(chǎn)地是甘肅。所有樣品經(jīng)干燥、粉碎之后通過80目篩再提取制樣,13號(hào)樣品用于薄層方法開發(fā)。

2 方法與結(jié)果

2.1 防風(fēng)藥材薄層色譜條件的考察

2.1.1 提取方法考察 在本人前期研究的基礎(chǔ)之上[14],選擇甲醇、85%甲醇、乙醇和85%乙醇作為超聲提取溶劑進(jìn)行考察,結(jié)果85%乙醇作為提取溶劑,條帶清晰,且乙醇安全無毒,故選用85%乙醇為提取溶劑。通過單因素循環(huán)考察不同固液比(1 ∶5,1 ∶10,1 ∶20)、不同提取時(shí)間(10,20,30 min),所得色譜圖見圖1-3,以特征條帶清晰不展寬、背景顏色淺為評(píng)價(jià)指標(biāo),結(jié)果表明用10倍量85%的乙醇室溫條件下超聲提取20 min時(shí)得到的色譜圖最好。

1.CRS;2.甲醇;3. 85%甲醇;4.乙醇; 5. 85%乙醇 (17 ℃, 57%)

圖1 提取溶劑的考察

Figure 1 Investigation of extraction solvents

1.CRS;2.固液比1 ∶5;3.固液比1 ∶10;4.固液比1 ∶20 (17.5 ℃, 59%)

圖2 提取固液比考察

Figure 2 Investigation of volume of solvent

1.CRS;2.提取10 min;3.提取20 min;4.提取30 min (17 ℃, 48%)

圖3 提取時(shí)間考察

Figure 3 Investigation of time of extraction

2.1.2 點(diǎn)樣量 用定量點(diǎn)樣管分別取2,5,8,10 μl供試品溶液,于同一高效薄層色譜板上各點(diǎn)成10 mm寬的條度,按照“2.3防風(fēng)高效薄層色譜鑒別”中所述方法操作。所得色譜圖見圖4。

對(duì)照品溶液(CRS)展開顯示5條色帶,從下往上,依次為升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、紫花前胡苷、亥茅酚苷和升麻素。結(jié)果顯示,隨著點(diǎn)樣量的增加,供試品中升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇葡萄糖苷、紫花前胡苷、亥茅酚苷和升麻素相應(yīng)條帶逐漸清晰。但是,當(dāng)點(diǎn)樣量達(dá)到8 μl時(shí)會(huì)出現(xiàn)條帶展寬,分離度下降。所以,點(diǎn)樣量選擇5 μl。

2.1.3 點(diǎn)樣寬度 用定量點(diǎn)樣管取5 μl供試品溶液,分別點(diǎn)2,4,6,8,10 mm寬的條帶于同一高效薄層色譜板上,按照“2.3防風(fēng)高效薄層色譜鑒別”中所述方法操作。所得色譜圖見圖5。

結(jié)果顯示,所有的薄層條帶在365 nm紫外燈下相似。隨著點(diǎn)樣寬度的增加,條帶愈發(fā)集中、清晰,能夠彼此有效分離。所以,點(diǎn)樣寬度選擇10 mm。

a.升麻苷;b.5-O-甲基維斯阿米醇苷;c.紫花前胡苷;d.亥茅酚苷;e.升麻素;1.CRS; 2. 2 μl; 3. 5 μl; 4. 8 μl; 5. 10 μl (17 ℃, 57%)圖4 點(diǎn)樣量的考察Figure 4 Investigation of volume of application

2.1.4 展開過程 分別取5 μl對(duì)照品溶液、對(duì)照品藥材溶液(BRM)和供試品溶液,分別點(diǎn)樣于A、B、C、D4塊高效薄層色譜板上,將這4塊高效薄層板分別放置在裝有展開劑Ⅰ:二氯甲烷-甲醇-甲酸(16 ∶4 ∶1)或展開劑Ⅱ:環(huán)己烷-乙酸乙酯(2 ∶1)的層析缸中,并按照表1所示方法展開,展開結(jié)束后,以10%硫酸-乙醇溶液為顯色劑,晾干后在365 nm下檢視,結(jié)果見圖6。

1. 2 mm; 2. 4 mm; 3. 6 mm; 4. 8 mm; 5. 10 mm (19.5 ℃, 49%)圖5 點(diǎn)樣寬度的考察Figure 5 Investigation of band width

表1四塊高效薄層色譜板展開過程

Table1Developingprocessofthefourhighperformancethinlayerchromatographyplates

薄層板展開過程 展開結(jié)果 A展開劑Ⅰ:8 cm極性大的黃酮類成分升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇葡萄糖苷、紫花前胡苷、亥茅酚苷和升麻素得到有效分離,但薄層色譜板上部極性小的物質(zhì)的條帶不能彼此有效分離B展開劑Ⅱ:8 cm極性大的黃酮類成分升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇葡萄糖苷、紫花前胡苷、亥茅酚苷和升麻素的RF值幾乎都為0C展開劑Ⅰ:5 cm,展開劑Ⅱ:8 cm極性大和極性小的成分都能得到有效分離,且沒有溶劑效應(yīng)D展開劑Ⅱ:8 cm,展開劑Ⅰ:5 cm第二次展開的溶劑前沿會(huì)影響色帶的觀察,且薄層色譜板上部極性小的物質(zhì)的條帶分離不如板C

結(jié)果表明,單獨(dú)使用展開劑A和展開劑B都不適合,所以二者都應(yīng)該被包含在展開過程中。為了使薄層板下部的黃酮類物質(zhì)得到有效分離且不與溶劑前沿過近,薄層板在展開劑Ⅰ中的展開距離減少至5 cm。D板出現(xiàn)了較為明顯的溶劑效應(yīng),而C板色譜中的升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇葡萄糖苷、紫花前胡苷、亥茅酚苷和升麻素均得到有效分離,且沒有溶劑效應(yīng)。所以C板的展開過程是合理的。

2.1.5 展開距離 分別取5 μl對(duì)照品溶液、對(duì)照品藥材溶液和供試品溶液,分別點(diǎn)樣于A、B、C、D4塊高效薄層色譜板上,將這4塊高效薄層板分別按照表2展開距離進(jìn)行展開,先放置在裝有展開劑Ⅰ的層析缸中展開,取出薄層板,干燥,把薄層板置于裝有展開劑Ⅱ的層析缸中展開。展開結(jié)束后,以10%硫酸-乙醇溶液為顯色劑,晾干后在365 nm下檢視,結(jié)果見圖7?？紤]到各物質(zhì)的分離效果以及展開過程所需時(shí)間,在展開劑Ⅰ中展開5 cm,在展開劑Ⅱ中展開8 cm是最為合理的展開距離。

2.2 色譜鑒定的方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 專屬性 分別取5 μl供試品溶液、防風(fēng)對(duì)照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.10 g/ml 85%乙醇)和濃度適宜的各對(duì)照品溶液,點(diǎn)條帶于同一高效薄層色譜板上,按照“2.3防風(fēng)高效薄層色譜鑒別”中所述方法操作。所得色譜圖見圖8。

所得色譜顯示,供試品溶液色譜中的RF值為0.09的淺藍(lán)色條帶,RF值為0.15的亮藍(lán)色條帶,RF值為0.18的強(qiáng)紫色條帶,RF值為0.22的淺黃色條帶和RF值為0.30的亮藍(lán)色條帶,它們所呈現(xiàn)的顏色和位置分別與升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇葡萄糖苷、紫花前胡苷、亥茅酚苷、升麻素對(duì)照品條帶一致。供試品溶液色譜中的所有條帶與防風(fēng)對(duì)照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜中條帶一致。

A.展開劑Ⅰ,上行展開8 cm B.展開劑Ⅱ,上行展開8 cm C.展開劑Ⅰ,上行展開5 cm;展開劑Ⅱ,上行展開8 cm D.展開劑Ⅱ,上行展開8 cm;展開劑Ⅰ,上行展開5 cm 1. CRS; 2. BRM; 3. 供試品溶液(17 ℃, 48%)圖6 展開過程的考察Figure 6 Investigation of developing process

表2四塊高效薄層板的展開距離

Table2Developingdistanceofthefourhighperformancethinlayerchromatographyplates

薄層板展開距離 展開結(jié)果 A展開劑Ⅰ:4 cm,展開劑Ⅱ:7 cm極性大的黃酮類成分升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇葡萄糖苷、紫花前胡苷、亥茅酚苷和升麻素不能得到有效分離B展開劑Ⅰ:5 cm,展開劑Ⅱ:8 cm極性大和極性小的成分都能得到有效分離,且時(shí)間合理C展開劑Ⅰ:6 cm,展開劑Ⅱ:10 cm極性大和極性小的成分都能得到有效分離,但消耗時(shí)間太長,不合理D展開劑Ⅰ:7 cm,展開劑Ⅱ:12 cm極性大和極性小的成分都能得到有效分離,但消耗時(shí)間太長,不合理

A.展開劑Ⅰ,上行展開4 cm;展開劑Ⅱ,上行展開7 cm B.展開劑Ⅰ,上行展開5 cm;展開劑Ⅱ,上行展開8 cm C.展開劑Ⅰ,上行展開6 cm;展開劑Ⅱ,上行展開10 cm D.展開劑Ⅰ,上行展開7 cm;展開劑Ⅱ,上行展開12 cm1. CRS; 2. BRM; 3. 供試品溶液(13 ℃, 60%)圖7 展開距離的考察Figure 7 Investigation of developing distance

2.2.2 穩(wěn)定性 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)使用供試品溶液,把供試品溶液分別在室溫下保存不同時(shí)間(0,1,2,3 d)后進(jìn)行。取5 μl供試品溶液,點(diǎn)樣于同一高效薄層色譜板上,按照“2.3防風(fēng)高效薄層色譜鑒別”中所述方法操作。所得色譜圖表明,供試品溶液在3 d內(nèi)具有穩(wěn)定性。

1. 升麻苷; 2. 5-O-甲基維斯阿米醇苷; 3. 紫花前胡苷; 4. BRM; 5-7. 供試品; 8. 亥茅酚苷; 9. 升麻素(17.5°, 46%)圖8 專屬性考察Figure 8 Investigation of specificity

2.2.3 耐用性

2.2.3.1 不同硅膠板 取5 μl對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液和供試品溶液,分別點(diǎn)樣于普通薄層色譜板和高效薄層色譜板上,按照“2.3防風(fēng)高效薄層色譜鑒別”中所述方法操作。所得色譜圖結(jié)果見圖9。

結(jié)果表明,高效薄層色譜板條帶窄、清晰、分離度好,國產(chǎn)普通薄層色譜條帶寬,分離度差。

A. 普通薄層板 B. 高效薄層板1. CRS; 2. BRM; 3. 供試品溶液(19 ℃, 55%)圖9 不同細(xì)度硅膠薄層板的考察Figure 9 Investigation of different thin layer plates of silica gel

2.2.3.2 熒光劑 取5 μl對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液和供試品溶液,分別點(diǎn)樣于不含熒光劑的薄層板HPTLC Silica gel 60和含熒光劑的薄層板HPTLC Silica gel 60 F254,按照“2.3防風(fēng)高效薄層色譜鑒別”中所述方法操作。所得色譜圖表明熒光劑對(duì)薄層條帶沒有顯著的影響。

2.2.3.3 不同廠家高效薄層板 取5 μl對(duì)照品溶液A、對(duì)照品溶液B和供試品溶液,分別點(diǎn)樣于不同廠家的高效薄層板上,按照“2.3防風(fēng)高效薄層色譜鑒別”中所述方法操作。所得色譜圖結(jié)果表明,HPTLC(默克)板條帶窄、清晰、分離度好,HPTLC(青島海洋)條帶寬(見圖10)。

A. 青島海洋,中國 B. 默克,德國1. CRS; 2. BRM; 3. 供試品溶液(19 ℃,55%)圖10 不同廠家高效薄層板的考察Figure 10 Investigation of different manufactories of the HPTLC precoated plates

2.2.3.4 不同展開溫度 取點(diǎn)樣后的高效薄層色譜板,分別在不同溫度下展開(12,19,25 ℃),相對(duì)濕度(RH%)為55%,展開過程按照“2.3防風(fēng)高效薄層色譜鑒別”中所述方法操作。結(jié)果表明,該方法對(duì)不同溫度的適應(yīng)性較好。

2.2.3.5 不同展開濕度 取點(diǎn)樣后的高效薄層色譜板,分別在不同濕度下展開(30%,55%,80%),溫度為19 ℃,展開過程按照“2.3防風(fēng)高效薄層色譜鑒別”中所述方法操作。結(jié)果表明,該方法對(duì)不同濕度的適應(yīng)性較好。

2.3 防風(fēng)高效薄層色譜鑒別

2.3.1 對(duì)照品溶液(CRS)的制備 分別取升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、紫花前胡苷、亥茅酚苷和升麻素對(duì)照品適量,精密稱定,加入甲醇溶解制成濃度分別為400.0 μg/ml, 300.0 μg/ml,10.00 μg/ml, 400.0 μg/ml和500.0 μg/ml的對(duì)照品溶液。搖勻,備用。

2.3.2 對(duì)照藥材溶液(BRM)的制備 取防風(fēng)對(duì)照藥材粉末約1 g適量置于錐形瓶中,加入85%乙醇10 ml,超聲提取20 min,離心取上清液,得濃度為100 mg/ml的防風(fēng)對(duì)照藥材溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 稱取防風(fēng)藥材粉末約1 g適量置于錐形瓶中,加入85%乙醇10 ml,超聲提取20 min,離心取上清液,得濃度為100 mg/ml的供試品溶液。

取上述防風(fēng)混合對(duì)照品、對(duì)照藥材、供試品,照薄層色譜法(《中國藥典》2015版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)。取混合對(duì)照品、對(duì)照藥材、供試品各5 μl,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以二氯甲烷-甲醇-甲酸(16 ∶4 ∶1)、環(huán)己烷-乙酸乙酯(2 ∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液顯色劑,晾干,置紫外燈(365 nm)下觀察。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材和對(duì)照品相應(yīng)位置上,均顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn),并可見其他條帶,呈現(xiàn)出指紋特征(見圖11,12)。

1. CRS; 2. BRM; 3-9. 供試品1-7(17.5 ℃,46%)圖11 防風(fēng)藥材的薄層色譜圖Figure 11 Thin layer chromatogram of sample 1-7

1. CRS; 2. BRM; 3-10. 供試品8-15(21 ℃, 54%)圖12 防風(fēng)藥材的薄層色譜圖Figure 12 Thin layer chromatogram of sample 8-15

3 討論

3.1 薄層色譜條件考察

本試驗(yàn)詳細(xì)考察了薄層鑒別的條件,色譜系統(tǒng)考察了點(diǎn)樣量、點(diǎn)樣寬度、展開系統(tǒng)和展開距離,色譜鑒定的方法學(xué)驗(yàn)證中考察了專屬性、穩(wěn)定性和耐用性(不同硅膠板,熒光劑,不同廠家高效薄層板,不同展開溫度及不同展開濕度)的影響。最終確定防風(fēng)高效薄層鑒別方法為:點(diǎn)樣量為5 μl,條帶寬10 mm,展開板為HPTLC Silica G60(Merck)。展開系統(tǒng)為展開劑Ⅰ:二氯甲烷-甲醇-甲酸(16 ∶4 ∶1),5 cm;展開劑Ⅱ:環(huán)己烷-乙酸乙酯(2 ∶1),8 cm。以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑,紫外燈365 nm下檢視,對(duì)防風(fēng)進(jìn)行了鑒別。且不同粒徑的硅膠板對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有明顯差別。熒光物質(zhì)的有無,不同廠家的高效薄層板,以及不同溫度和濕度對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液的色譜條帶沒有顯著影響。

3.2 鑒別指標(biāo)的選擇

本試驗(yàn)以升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、紫花前胡苷、亥茅酚苷和升麻素為指標(biāo)進(jìn)行薄層鑒別。在《中國藥典》2015年版中,防風(fēng)薄層鑒別僅選擇了升麻苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷兩種成分進(jìn)行鑒別指認(rèn),不具有專屬性。因此,本研究增加了紫花前胡苷、亥茅酚苷和升麻素三種活性成分作為指標(biāo)成分,提高了薄層鑒別的專屬性。

3.3 提取條件的選擇

《中國藥典》2015年版中薄層供試品溶液制備過程較復(fù)雜,需將超聲提取后的溶液過濾,蒸干復(fù)溶。本試驗(yàn)考察了不同的提取溶劑、溶劑倍量和提取時(shí)間,最終選擇以10倍量85%乙醇作為提取溶劑,超聲20 min,濾過作為供試品溶液。簡化了供試品溶液的制備過程,有利于大批量防風(fēng)的薄層鑒別。

3.4 展開條件的選擇

《中國藥典》2015年版展開系統(tǒng)為三氯甲烷-甲醇(4 ∶1),三氯甲烷為第二類溶劑,有動(dòng)物致癌性,且得到的條帶顏色淺,數(shù)目少。對(duì)展開系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳條件為:二次展開,展開劑Ⅰ:二氯甲烷-甲醇-甲酸(16 ∶4 ∶1),展開劑Ⅱ:環(huán)己烷-乙酸乙酯(2 ∶1)。且采用高效薄層色譜,與普通薄層鑒別或者單純一次展開所得結(jié)果相比,本試驗(yàn)所得高效薄層色譜條帶清晰,相似成分分離度好,呈現(xiàn)出指紋性[15]。該方法操作簡單、重現(xiàn)性好,可作為防風(fēng)藥材定性鑒別的一種方法,為防風(fēng)藥材的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

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