初發(fā)急性髓性白血病患者外周血中高表達(dá)TAL1基因及其意義*

何子凡，丘 丹，廖紫薇，陳少華，吳秀麗，李揚(yáng)秋

(暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院血液病研究所， 廣東 廣州 510632)

TAL1又稱為干細(xì)胞白血病基因，是重要的調(diào)控造血分化的轉(zhuǎn)錄因子，屬堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族成員[1]。TAL1表達(dá)于正常原始造血細(xì)胞中，在造血和胚胎血管發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，它通過調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)來影響造血細(xì)胞的發(fā)育和分化[2-3]。T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)患者常見TAL1高表達(dá)，并與預(yù)后不良相關(guān)[2，4]。但TAL1在其它類型白血病,如成人常見白血病類型——急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)細(xì)胞中表達(dá)情況并不清楚，因此，我們對初發(fā)AML患者外周血中TAL1基因的表達(dá)水平進(jìn)行了定量檢測。

材 料 和 方 法

1 研究對象

收集本研究所自行保存的急性白血病細(xì)胞株樣本，包括T-ALL細(xì)胞株(Jurkat細(xì)胞株和CCRF-CEM細(xì)胞株)及AML細(xì)胞株(HL-60細(xì)胞株和NB4細(xì)胞株)；收集經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)染色及流式細(xì)胞術(shù)免疫學(xué)分型確診的47例初發(fā)急性髓性白血病患者的外周血樣本(男27例，女20例；年齡20～77歲，中位年齡36.0歲)，其中包括10例AML-M1型，9例AML-M2型，9例AML-M3型，10例AML-M4型及9例AML-M5型；同時(shí)收集12例健康志愿者外周血樣本作為健康對照組(男6例，女6例，年齡20～51歲，中位年齡28.5歲)。采樣通過醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，已征得患者及健康獻(xiàn)血者的同意并簽署知情同意書。

2 RNA提取和cDNA合成

收集肝素抗凝外周血樣本后，常規(guī)方法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。用TRIzol試劑盒(Invitrogen)分別提取所收集的PBMCs和白血病細(xì)胞株樣本的RNA，并應(yīng)用隨機(jī)引物和SuperScript III反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并檢測合成cDNA的質(zhì)量。

3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI基因庫的TAL1基因序列(Gene ID：6886)，分別設(shè)計(jì)上游引物(5’-GGATGCCTTCCCTATGTTCA-3’)和下游引物(5’-AAGATACGCCGCACAACTTT-3’);以β-actin作為內(nèi)參照，設(shè)計(jì)其上游引物(5’-AGAAAATCTGGCACCACACC-3’)和下游引物(5’-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3’)。引物均由上海英濰捷基公司合成。

4 Real-time PCR

參照RealMaster Mix試劑盒(Tiangen)說明書，以β-actin作為內(nèi)參照，利用SYBR Green I染料檢測PBMCs中TAL1的mRNA表達(dá)水平。總反應(yīng)體系為20 μL，包括2.5×RealMaster Mix(Tiangen)10 μL、0.4 mmol/L上、下游引物以及1 μL cDNA；每一標(biāo)本設(shè)2個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min；在82 ℃設(shè)讀板檢測熒光。擴(kuò)增完后，進(jìn)行熔解曲線分析，以0.17 ℃ /s變化速度從55 ℃～95 ℃每隔2 s記錄1次熒光值，獲得熔解曲線。反應(yīng)在Chromo 4實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad)上進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照和陽性對照。采用2-ΔΔCt法分析目的基因TAL1的相對表達(dá)水平。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)或Welch檢驗(yàn)進(jìn)行正常對照組與AML細(xì)胞株或AML患者外周血樣本中TAL1 mRNA相對表達(dá)水平的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TAL1 mRNA在急性白血病細(xì)胞株中的表達(dá)水平

既往研究顯示T-ALL中TAL1異常高表達(dá)，因此，本實(shí)驗(yàn)首先檢測T-ALL細(xì)胞株Jurkat和CCRF-CEM中TAL1的表達(dá)情況作為基本數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示Jurkat細(xì)胞和CCRF-CEM細(xì)胞中TAL1 mRNA的表達(dá)水平均高于健康對照組，其中Jurkat細(xì)胞的表達(dá)水平更高。我們進(jìn)一步檢測了AML細(xì)胞HL-60和NB4細(xì)株中TAL1 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HL-60細(xì)胞中TAL1的表達(dá)水平明顯高于T-ALL細(xì)胞株，而NB4細(xì)胞中TAL1的表達(dá)水平較健康對照組也有一定程度的增加(P<0.05),見圖1。

2 TAL1 mRNA在AML患者PBMCs中的表達(dá)水平

我們進(jìn)一步分析原代AML細(xì)胞樣本中TAL1的表達(dá)特點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAL1 mRNA在AML患者外周血中的表達(dá)水平顯著高于健康對照組(P<0.05)。我們對不同亞型的初發(fā)AML患者PBMCs中TAL1的mRNA表達(dá)水平也進(jìn)行了定量分析，結(jié)果顯示初發(fā)AML-M1、AML-M2、AML-M3、AML-M4和AML-M5中的TAL1 mRNA表達(dá)水平均顯著高于健康對照組(P<0.05),見圖2。我們還分析了不同亞型AML患者的TAL1的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)雖然TAL1在AML-M1和AML-M5亞型中呈現(xiàn)較高的水平，但是統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果顯示AML各種亞型之間的TAL1基因表達(dá)水平均無顯著差異，見圖2。

討 論

TAL1基因位于1p32，首先是在1例罕見伴有t(1；14)(p32；q11)染色體易位的T-ALL中發(fā)現(xiàn)的，主要的遺傳學(xué)改變是在1號染色體TAL1基因的5′非編碼區(qū)和SIL基因之間存在一段90 kb的缺失，形成SIL/TAL1融合基因，導(dǎo)致TAL1高表達(dá)[5]，這種TAL1重排可見于25%～30%的T-ALL。SIL/TAL1重排與不良預(yù)后相關(guān)，高發(fā)溶瘤綜合征和彌漫性血管內(nèi)凝血，死亡率高，無病生存期和總生存期短。SIL/TAL1+T-ALL小鼠模型中也有類似發(fā)現(xiàn)[6]。在小于9歲的兒童T-ALL中，伴有SIL/TAL1陽性提示預(yù)后不良[7]。造血干細(xì)胞移植后出現(xiàn)SIL/TAL1融合基因陰性轉(zhuǎn)陽性或者TAL1基因高表達(dá)的T-ALL患者存在早期復(fù)發(fā)，可作為移植后微小殘留病變的新檢測指標(biāo)[8]。但是，1項(xiàng)來自歐洲的兒童T-ALL臨床研究報(bào)道，由于SIL/TAL1伴有較多的髓外復(fù)發(fā)，382例兒童T-ALL中，16%伴有SIL/TAL1的患兒總體預(yù)后與SIL/TAL1陰性組無顯著差異[9]。因此，需要從多個(gè)方面深入探討TAL1基因與白血病發(fā)病的相關(guān)性。

Figure 1. Relative mRNA levels of TAL1 in acute leukemia cell lines (Jurkat, CCRF-CEM, HL-60, NB4) and PBMCs of healthy individuals (HI). Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsHI group;△P<0.05vsHL-60 group.

圖1TAL1mRNA在健康人外周血PBMCs和急性白血病細(xì)胞株中的水平

Figure 2. Relative mRNA expression levels of TAL1 in PBMCs of acute myeloid leukemia (AML) patients and healthy individuals (HI). The short dash represents the median value.

圖2TAL1mRNA在健康人和AML患者外周血PBMCs中的水平

目前對TAL1基因的研究多數(shù)集中于T-ALL中，關(guān)于TAL1基因在其它類型白血病中的表達(dá)情況并不清楚。AML是一類成人常見的惡性血液病，具有高度異質(zhì)性，伴有不良細(xì)胞遺傳學(xué)或分子遺傳學(xué)者預(yù)后較差。為了解TAL1基因與AML發(fā)病的相關(guān)性，我們首先檢測了急性白血病細(xì)胞株中TAL1基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TAL1基因不但高表達(dá)于T-ALL細(xì)胞株Jurkat和CCRF-CEM中，而且在AML細(xì)胞株HL-60和NB4中也呈高表達(dá)，甚至出現(xiàn)更高的表達(dá)水平，我們進(jìn)一步證實(shí)了初發(fā)的原代AML細(xì)胞中TAL1基因也存在異常高表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)TAL1基因的高表達(dá)可以誘導(dǎo)T細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，與T-ALL發(fā)病相關(guān)[1-2]，而TAL1在AML中的作用尚不明確。TAL1表達(dá)于正常原始造血細(xì)胞中，在造血和胚胎血管發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。其中，共同髓樣前體細(xì)胞(common myeloid precursor，CMP)轉(zhuǎn)化為粒系/單核系祖細(xì)胞(granulocyte-macrophage progenitor，GMP)的過程中依賴TAL1的參與，隨著分化成熟，TAL1的表達(dá)水平下調(diào)[10]。由此，我們推測其異常高表達(dá)可能影響粒系的分化發(fā)育，參與AML的發(fā)病。TAL1的異常高表達(dá)可能是通過TAL1基因異常甲基化而介導(dǎo)的，有報(bào)道顯示在AML小鼠模型中發(fā)現(xiàn)存在TAL1基因的異常甲基化[11]，也有研究發(fā)現(xiàn)TAL1的表達(dá)模式受TAL1基因甲基化影響[12]。這可能是有別于T-ALL的TAL1基因異常表達(dá)介導(dǎo)AML發(fā)生的另一種模式，但還有待進(jìn)一步的證實(shí)。本研究中還發(fā)現(xiàn)TAL1基因在AML-M1和AML-M5亞型中呈現(xiàn)較高的表達(dá)水平，可能與這兩種AML亞型病人的外周血或骨髓中幼稚細(xì)胞較多相關(guān)。但可能由于樣本量的限制，AML各種亞型之間的TAL1基因表達(dá)水平未顯示顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量加以證實(shí)。

致謝：本文作者感謝美國佛羅里達(dá)大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)系Suming Huang教授對TAL1基因研究給予的指導(dǎo)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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