TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠中細(xì)菌鞭毛蛋白的表達(dá)及其與肥大細(xì)胞脫顆粒的關(guān)系*

路 瑤，郝卉杰，賀 欣，張目涵，趙美華，馬 娜，馮百歲

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 炎癥性腸病中心， 吳階平醫(yī)學(xué)基金會(huì)， 炎癥性腸病聯(lián)盟河南省炎癥性腸病中心， 河南 鄭州 450014)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一組以腹痛、腹瀉及黏液膿血便等為主要臨床表現(xiàn)的慢性炎性疾病，其病因尚不明確?，F(xiàn)有的研究表明IBD與腸黏膜屏障破壞以及異常免疫應(yīng)答相關(guān)[1]。目前研究表明腸道炎癥的發(fā)生與腸道內(nèi)菌群的作用密不可分[2]。正常人腸道內(nèi)即存在大量的抗原物質(zhì), 包括正常定植菌群、某些致病菌和細(xì)菌毒素等[3]，這些抗原物質(zhì)可誘導(dǎo)腸黏膜產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞，同時(shí)導(dǎo)致免疫功能紊亂，從而在IBD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用[4]。 細(xì)菌鞭毛蛋白CBir1可與Toll樣受體5(Toll-like receptor 5，TLR5)等受體結(jié)合，激發(fā)相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而參與腸道慢性炎癥反應(yīng)[5]。肥大細(xì)胞是黏膜免疫的重要組成部分，目前研究發(fā)現(xiàn)在IBD患者的腸黏膜中活化的肥大細(xì)胞增多。激活的肥大細(xì)胞發(fā)生脫顆粒作用，可分泌出肥大細(xì)胞類(lèi)胰蛋白酶(mast cell tryptase，MCT)及組胺等細(xì)胞因子進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生[6-7]。細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)能夠直接損傷細(xì)胞，當(dāng)其與卵清蛋白(ovalbumin，OVA)結(jié)合后可促進(jìn)炎癥反應(yīng)[8]。酮替芬(ketotifen)是一種常見(jiàn)的抗過(guò)敏藥物，其能夠穩(wěn)定肥大細(xì)胞細(xì)胞膜，從而減少炎癥物質(zhì)的釋放。人類(lèi)IBD的炎癥反應(yīng)過(guò)程尚不明確，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可模擬該疾病發(fā)病過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導(dǎo)建立小鼠慢性結(jié)腸炎模型，并對(duì)各組小鼠采取相應(yīng)的干預(yù)措施。實(shí)驗(yàn)中采用免疫組織化學(xué)以及ELISA方法來(lái)檢測(cè)各組腸黏膜組織及血清中CBir1、TLR5、組胺及MCT的表達(dá)，分析疾病進(jìn)程中上述指標(biāo)含量的變化,并結(jié)合分析CBir1的含量與上述肥大細(xì)胞脫顆粒相關(guān)指標(biāo)之間的相關(guān)性，分析兩者在TNBS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎中的作用，為臨床IBD的研究和疾病的治療提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 材料

健康雄性6～8周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠72只，體重18～22 g，購(gòu)自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證許可證號(hào)為SCXK(豫)2010—0002。LPS、TNBS、OVA、富馬酸酮替芬購(gòu)自Sigma；小鼠類(lèi)胰蛋白酶、組胺以及抗CBir1抗體ELISA試劑盒購(gòu)自R&D；過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)自博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠CBir1抗體和TLR5抗體購(gòu)自UCL；兔抗小鼠類(lèi)胰蛋白酶β2抗體購(gòu)自福州邁新生物科技公司。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組和處理 實(shí)驗(yàn)小鼠共分為6組，每組各12只，隨機(jī)分為：(1)正常對(duì)照(normal control)組：無(wú)特殊處理，正常飼養(yǎng); (2)生理鹽水(saline)組：禁食不禁水24 h，實(shí)驗(yàn)第1、8和15天給予生理鹽水(100 μL)灌腸，實(shí)驗(yàn)后正常飲食；(3)50%乙醇(50% alcohol)組：第1、8和15天給予50%乙醇(100 μL)灌腸;(4)50%乙醇+TNBS (50% alcohol+TNBS)組：第1、8和15天分別給予由2.0 mg TNBS、2.5 mg TNBS和3.0 mg TNBS加50%乙醇配置成的100 μL溶液灌腸； (5) 50%乙醇+TNBS+酮替芬(50% alcohol+TNBS+ketotifen)組：用生理鹽水加酮替芬0.5 mg配成100 μL溶液，給予該組小鼠腹腔注射，30 min后灌腸，TNBS劑量及灌腸方法同(4)組; (6) 50%乙醇+TNBS+LPS+OVA組：取OVA 20 μg和LPS 10 μg溶于100 μL 生理鹽水中，于第7天給予該組小鼠腹腔注射，第9、12及15天重復(fù)上述過(guò)程,后將OVA 50 μg溶于100 μL生理鹽水配成溶液，于第18、19、20和21天按每只100 μL的劑量行腹腔注射，TNBS劑量和灌腸方法同(4)組。實(shí)驗(yàn)第22天處死小鼠，收集血液并離心20 min(2 000～3 000 r/min)后取上清儲(chǔ)存至-20 ℃;取小鼠結(jié)腸組織，4%甲醛固定，石蠟包埋并凍存，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

2.2病理評(píng)分 根據(jù)Irving等[9]提出的疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分(disease activity index，DAI)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組小鼠一般情況進(jìn)行評(píng)估并取各組平均值為DAI分值。組織學(xué)損傷評(píng)分(histological index，HI):取小鼠結(jié)腸組織的石蠟切片，根據(jù)Ewaschuk等[10]的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠結(jié)腸進(jìn)行HI評(píng)估,讀片及評(píng)分采用雙盲法，結(jié)果取均值。

2.3免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織內(nèi)CBir1、TLR5和MCT的表達(dá) 取小鼠結(jié)腸組織石蠟切片，并通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)各組組織內(nèi)TLR5、 CBir1及MCT含量，并采用定性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。具體實(shí)驗(yàn)方法為：石蠟切片水化→抗原修復(fù)→3% H2O2孵育→血清封閉→加I抗過(guò)夜→復(fù)溫→加II抗→加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素→避光滴加DAB顯色劑→自來(lái)水沖洗終止顯色→蘇木素復(fù)染→70%鹽酸乙醇分化→脫水→樹(shù)膠封片。具體判定標(biāo)準(zhǔn)為：(1)陽(yáng)性細(xì)胞≤5%計(jì)為0分，6%～25%計(jì)為l分，26%～50%計(jì)為2分，51%～75%計(jì)為3分，>75%計(jì)為4分；(2)陽(yáng)性強(qiáng)度：無(wú)色計(jì)為0分，淡黃色計(jì)為1分，黃色計(jì)為2分，棕黃色計(jì)為3分；將(1)和(2)兩者積分相乘，0分視為陰性(-)，1～4分視為弱陽(yáng)性(+)，5～8分視為陽(yáng)性(++)，9～12分視為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。上述結(jié)果均為在高倍鏡(×400)下觀察得出，每個(gè)標(biāo)本觀察5個(gè)不重復(fù)視野，結(jié)果取平均值。

2.4血清抗-CBir1抗體、MCT和組胺的ELISA檢測(cè) 采用ELISA檢測(cè)各組小鼠血清中MCT、抗-CBir1抗體及組胺的含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物吸光度(A)值及對(duì)應(yīng)的濃度，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程式。將測(cè)得的各組的A值，代入方程式中，得各組樣品的實(shí)際濃度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理。對(duì)稱(chēng)分布計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)進(jìn)行描述。正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)采用Levene檢驗(yàn)法檢驗(yàn)方差齊性，并采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差分析有意義者采用SNK-q法進(jìn)行兩兩比較。非正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較。定性資料的兩兩比較采用秩和檢驗(yàn)。變量間相關(guān)性描述采用Pearson積矩相關(guān)系數(shù)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠一般狀況及DAI評(píng)分比較

分別記錄各組小鼠實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后一般情況變化，正常對(duì)照組小鼠的飲食及飲水均正常，精神狀態(tài)未見(jiàn)明顯異常，體重增加，無(wú)死亡；生理鹽水組10%～15%小鼠稀便，其余同正常對(duì)照組；50%乙醇組實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后約20%的小鼠飲食量減少、排稀便，約10%的小鼠出現(xiàn)潛血+～++，體重減輕，1周后逐漸恢復(fù)體重,死亡率為0；50%乙醇+TNBS組實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后出現(xiàn)食量減少、排軟便或稀便，大便潛血+～+++，精神萎靡、體重下降，且第3周達(dá)癥狀高峰,灌腸開(kāi)始后第1、2周出現(xiàn)動(dòng)物死亡現(xiàn)象,死亡率16.67%；50%乙醇+TNBS+酮替芬組小鼠實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后癥狀較50%乙醇+TNBS組輕，第8天體重恢復(fù)90%左右，小鼠死亡率8.33%；50%乙醇+TNBS+LPS+OVA組動(dòng)物上述癥狀嚴(yán)重，體重下降較為明顯,死亡率25%。小鼠體重下降情況及DAI評(píng)分比較見(jiàn)圖1。

Figure 1. The results of body weight loss and DAI score in each group of mice. Mean±SD.n=12.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vs50% alcohol+TNBS group.

圖1各組小鼠體重下降情況及DAI評(píng)分結(jié)果的比較

2 各組小鼠結(jié)腸黏膜組織學(xué)改變及HI評(píng)分比較

用放大鏡對(duì)各組小鼠的腸道組織進(jìn)行初步觀察,正常對(duì)照組、生理鹽水組及50%乙醇組腸黏膜較平滑、未見(jiàn)明顯充血腫脹及明顯淋巴濾泡增生；各模型組腸黏膜見(jiàn)顆粒狀突起，部分結(jié)腸見(jiàn)扭曲變形、充血及少量黏膜糜爛。

光鏡下組織切片可見(jiàn)：正常對(duì)照組和生理鹽水組小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞連續(xù)，腺體結(jié)構(gòu)清晰，排列規(guī)則，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；50%乙醇組腸黏膜上皮細(xì)胞連續(xù), 黏膜層見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體結(jié)構(gòu)無(wú)明顯破壞；50%乙醇+TNBS組腸黏膜欠完整，腸上皮細(xì)胞破碎，杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，淋巴濾泡數(shù)量增多，固有層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),病變較嚴(yán)重區(qū)域，可見(jiàn)腸上皮小片狀壞死，黏膜下層及固有肌層均見(jiàn)小血管增生；50%乙醇+TNBS+酮替芬組腸黏膜缺乏完整性，腸上皮細(xì)胞破裂，杯狀細(xì)胞減少，黏膜層存在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層亦可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞；50%乙醇+TNBS+LPS+OVA組小鼠組織損傷程度較50%乙醇+TNBS組嚴(yán)重，炎癥侵犯全層，大量腺體結(jié)構(gòu)消失，部分見(jiàn)固有層增厚。各組小鼠結(jié)腸黏膜進(jìn)行HI評(píng)分并比較見(jiàn)圖2。

Figure 2. The results of HI soore in each group of mice. Mean±SD.n=12.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vs50% alcohol+TNBS group.

圖2小鼠腸黏膜組織HI評(píng)分比較

3 各組小鼠結(jié)腸黏膜CBir1、TLR5和MCT的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示CBir1在結(jié)腸組織分布于腸上皮細(xì)胞膜，而MCT及TLR5分布于結(jié)腸組織腸上皮細(xì)胞質(zhì)中。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比及染色程度判定結(jié)果，可見(jiàn)各組結(jié)腸組織的染色程度明顯不同，其中，50%乙醇+TNBS組中CBir1、MCT和TLR5較正常對(duì)照組陽(yáng)性數(shù)增多(P<0.05),加入酮替芬后CBir1和TLR5陽(yáng)性數(shù)較50%乙醇+TNBS組減少，加入LPS和OVA后，CBir1和MCT陽(yáng)性數(shù)較50%乙醇+TNBS組增多(P<0.05),見(jiàn)圖3、表1～3。

4 各組小鼠血清抗-CBir1、MCT和組胺濃度的變化

采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較，ELISA結(jié)果提示50%乙醇+TNBS模型組中血清MCT、抗-CBir1及組胺的水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；將正常對(duì)照組與生理鹽水組和50%乙醇組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，因而排除了機(jī)械損傷及單獨(dú)乙醇的作用對(duì)本實(shí)驗(yàn)影響,說(shuō)明50%乙醇導(dǎo)致的慢性炎癥與灌腸所致腸黏膜機(jī)械損傷無(wú)關(guān)。與50% alcohol+TNBS組相比，50% alcohol+TNBS+ketotifen組血清抗-CBir1、MCT和組胺水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示酮替芬對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有治療作用；50% alcohol+TNBS+LPS+OVA組與50% alcohol+TNBS組相比，上述指標(biāo)濃度增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明LPS和OVA可加重結(jié)腸炎的程度，見(jiàn)圖4。

5 血清抗-CBir1濃度與MCT和組胺濃度的相關(guān)性分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別繪制血清中上述3個(gè)指標(biāo)的散點(diǎn)圖，結(jié)果呈線(xiàn)性趨勢(shì),表明血清中抗-CBir1的濃度與MCT及組胺的濃度相關(guān)聯(lián)；觀察各組資料均服從正態(tài)分布，且各觀察值間相互獨(dú)立，可采用Pearson積矩相關(guān)系數(shù)來(lái)描述血清抗-CBir1濃度與上述兩指標(biāo)之間的關(guān)系。結(jié)果分別得出血清抗-CBir1與組胺濃度相關(guān)系數(shù)r=0.751(P<0.01)；血清抗-CBir1與MCT濃度相關(guān)系數(shù)r=0.648 (P<0.01)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可得出血清中抗-CBir1與MCT的濃度呈正相關(guān)關(guān)系，小鼠血清中抗-CBir1與組胺的濃度亦呈正相關(guān),見(jiàn)圖5。

討 論

IBD是一種以腹痛、腹瀉及黏液膿血便等為主要臨床表現(xiàn)的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其目前的發(fā)病機(jī)制尚不明確[11]。50%乙醇+TNBS誘導(dǎo)的鼠結(jié)腸炎模型是目前廣泛應(yīng)用于IBD研究的動(dòng)物模型[12]。乙醇對(duì)腸道黏膜屏障有破壞作用，破壞后的腸黏膜暴露出角蛋白可與TNBS結(jié)合形成完全抗原，并通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等途徑激發(fā)免疫反應(yīng)[13]。

細(xì)菌的鞭毛是細(xì)菌主要的運(yùn)動(dòng)器官，主要作用包括侵襲、黏附及分泌毒力因子等。細(xì)菌鞭毛蛋白對(duì)細(xì)菌鞭毛的黏附能力、定植以及破壞腸黏膜屏障有重要作用[14]。CBir1是細(xì)菌鞭毛蛋白中的一種，具有許多鞭毛蛋白的共性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非模型組小鼠的腸黏膜組織及血清中可檢測(cè)到少量的CBir1和抗-CBir1，明顯低于TNBS誘導(dǎo)模型組,表明CBir1參與了小鼠TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的發(fā)病過(guò)程。

Figure 3. The expression of CBir1 (A), TLR5 (B) and MCT (C) in mouse colonic epithelial tissue (×400).

圖3小鼠結(jié)腸組織中CBir1、TLR5和MCT的表達(dá)

TLRs是一類(lèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受體，主要在先天性免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用[15]。目前研究表明細(xì)菌鞭毛蛋白可以識(shí)別TLR5，觸發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)[16],兩者結(jié)合后，可激活骨髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而促進(jìn)NF-κB的激活及釋放[17]。激活的NF-κB促進(jìn)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄基因上調(diào)，使腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukine，IL)-1β和IL-8等前炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生增加，從而參與機(jī)體的先天性免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)[18]。上述兩者結(jié)合后，亦可促使細(xì)胞的caspase-8及Fas相關(guān)死亡域蛋白表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19]。本實(shí)驗(yàn)表明，TNBS誘導(dǎo)模型組小鼠的腸黏膜組織中TLR5的表達(dá)量，明顯高于非模型組。表明TLR5參與了小鼠TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的發(fā)病過(guò)程。

表1CBir1免疫組化結(jié)果
Table 1. Immunohistochemical expression of CBir1 in colonic epithelial tissue of mice in each group (n=12)

Group-++++++Normol control11100Saline1002050% alcohol912050% alcohol+TNBS320750% alcohol+TNBS+ketotifen632150% alcohol+TNBS+LPS+OVA00111

表2TLR5免疫組化結(jié)果
Table 2. Immunohistochemical expression of TLR5 in colonic epithelial tissue of mice in each group (n=12)

Group-++++++Normol control10200Saline1021050% alcohol921050% alcohol+TNBS311750% alcohol+TNBS+ketotifen614150% alcohol+TNBS+LPS+OVA00012

表3MCT免疫組化結(jié)果
Table 3. Immunohistochemical expression of MCT in colonic epithelial tissue of mice in each group (n=12)

Group-++++++Normol control10200Saline1011050% alcohol930050% alcohol+TNBS401750% alcohol+TNBS+ketotifen523250% alcohol+TNBS+LPS+OVA00111

Figure 4. Comparison of serum MCT, histamine and anti-CBir1 concentrations in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vs50% alcohol+TNBS group.

圖4各組實(shí)驗(yàn)小鼠血清中的MCT、組胺及抗-CBir1濃度比較

Figure 5. The scatter diagram showed the relationship between anti-CBir1 and MCT or histamine levels in each group.

圖5血清抗-CBir1與MCT和組胺濃度關(guān)系的散點(diǎn)圖

腸道免疫相關(guān)疾病發(fā)生時(shí)，肥大細(xì)胞的數(shù)量增加，同時(shí)肥大細(xì)胞脫顆粒釋放的介質(zhì)，如組胺、MCT、IL-5和TNF增加[20]。肥大細(xì)胞中含有大量的組胺，當(dāng)肥大細(xì)胞被激活時(shí)，可釋放組胺促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生。組胺受體HR1和HR2激活后，可通過(guò)影響血管、平滑肌及上皮細(xì)胞的功能，參與炎癥反應(yīng);同時(shí)，組胺是一種高效的促類(lèi)胰蛋白酶釋放刺激劑。MCT能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，其釋放及儲(chǔ)存均有高度的選擇性。因此，MCT是評(píng)估肥大細(xì)胞激活以及脫顆粒的標(biāo)志之一。MCT具有刺激外周血T細(xì)胞、單核細(xì)胞活化，并誘導(dǎo)其釋放IL-6及TNF-α等眾多細(xì)胞因子的作用，從而加重炎癥反應(yīng)。同時(shí)肥大細(xì)胞釋放的MCT可反作用于肥大細(xì)胞，促使更多肥大細(xì)胞的激活，形成 “瀑布”效應(yīng)[21]。本實(shí)驗(yàn)表明，TNBS誘導(dǎo)模型組小鼠的腸黏膜組織中MCT及血清中組胺的表達(dá)量，明顯高于非模型組。表明TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的發(fā)病過(guò)程中存在肥大細(xì)胞激活。已有研究表明肥大細(xì)胞表達(dá)TLR5，而TLR5可識(shí)別CBir1并啟動(dòng)炎癥反應(yīng)[22]。因此我們推測(cè)CBir1可通過(guò)與TLR5結(jié)合而激活肥大細(xì)胞。

LPS是構(gòu)成G-厭氧菌細(xì)胞壁的主要成分。研究表明其可與LPS結(jié)合蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，并作用于細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體，例如Toll樣受體。通過(guò)上述途徑將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞及肥大細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞因子的合成及釋放，如IL-10和IL-15等。LPS通過(guò)上述途徑可參與腸道的炎癥反應(yīng)[23-24]。OVA常與LPS使用于誘導(dǎo)腸黏膜的免疫反應(yīng)，主要通過(guò)Toll樣受體等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程來(lái)促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[25-26]。本實(shí)驗(yàn)中50%乙醇+TNBS+LPS+OVA組小鼠的DAI評(píng)分、HI評(píng)分均較50%乙醇+TNBS組明顯升高，因此可見(jiàn)炎癥反應(yīng)加重。

酮替芬能促進(jìn)肥大細(xì)胞細(xì)胞膜穩(wěn)定的維持，因而減少過(guò)敏活性介質(zhì)的釋放。同時(shí)對(duì)H1受體具有較強(qiáng)的拮抗作用，因此具有抗組胺作用[27]。從本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析顯示50%乙醇+TNBS+酮替芬組小鼠的各項(xiàng)評(píng)估指標(biāo)均較50%乙醇+TNBS組明顯降低，充分表明了酮替芬具有抑制小鼠TNBS結(jié)腸炎的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示50%乙醇+TNBS組、50%乙醇+TNBS+酮替芬組和50%乙醇+TNBS+LPS+OVA組疾病嚴(yán)重程度的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且加入LPS+OVA組炎癥最重，而TNBS模型組結(jié)腸組織中CBir1、TLR5及MCT的表達(dá)均與疾病的嚴(yán)重程度趨勢(shì)一致，嚴(yán)重程度越深，表達(dá)越高。同時(shí)TNBS模型組血清中抗-CBir1、組胺及MCT的表達(dá)，亦與疾病的嚴(yán)重程度趨勢(shì)一致。

采用Pearson積矩相關(guān)系數(shù)分析得，血清抗-CBir1與MCT濃度呈正相關(guān),血清中組胺的濃度與抗-CBir1的濃度亦呈正相關(guān),說(shuō)明CBir1的表達(dá)量可能與肥大細(xì)胞脫顆粒作用相關(guān)。結(jié)合相關(guān)研究報(bào)道與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)CBir1參與肥大細(xì)胞的激活過(guò)程可能也和TLR5相關(guān)。

綜上所述，通過(guò)TNBS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎，可以模擬動(dòng)物IBD模型。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同的干預(yù)措施，模擬不同程度的炎癥反應(yīng)，即LPS+OVA可加重炎癥過(guò)程，酮替芬作為肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑，可一定程度減輕炎癥的發(fā)生。隨著干預(yù)的措施變化，各組小鼠的DAI、HI評(píng)分、MCT、CBirl、TLR5及組胺亦呈現(xiàn)出不同程度的表達(dá)。CBir1的表達(dá)量與肥大細(xì)胞脫顆粒作用呈正相關(guān)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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