miR-125a-5p通過(guò)GSK-3β/Snail信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化*

王照巖，楊玉玲，楊志一，尹崇高，李洪利，劉雨清△

(濰坊醫(yī)學(xué)院 1病理學(xué)教研室， 2醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心， 3護(hù)理學(xué)院， 山東 濰坊 261053)

乳腺癌是全球女性腫瘤相關(guān)死亡的主要疾病，每年有超過(guò)150萬(wàn)的新確診病例[1]。盡管通過(guò)手術(shù)、放療和化療的聯(lián)合應(yīng)用，已大大提高了早期乳腺癌患者的生存率，但晚期患者的臨床生存率仍不容樂(lè)觀[2]。因此，研究乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為提高病人的生存率提供新的理論依據(jù)。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一種非編碼單鏈RNA分子，大約由22個(gè)核苷酸組成，可通過(guò)對(duì)靶基因的mRNA進(jìn)行特異性堿基配對(duì)，調(diào)控靶基因的翻譯過(guò)程，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)[3]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)特征的一種現(xiàn)象，通過(guò)EMT，具有間質(zhì)特征的腫瘤細(xì)胞明顯增強(qiáng)了侵襲與遷移能力。新的研究表明，EMT在腫瘤細(xì)胞遷移的早期過(guò)程起著關(guān)鍵作用，并可通過(guò)多種信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[4]。miRNA在EMT中扮演著重要的角色，如miR-655[5]和miR-208[6]通過(guò)誘導(dǎo)EMT的發(fā)生促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2，GRB2)相關(guān)結(jié)合蛋白2(GRB2-associated-binding protein 2，GAB2)是DOS/GAB家族的成員，通過(guò)整合多種信號(hào)通路，參與多種類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p能夠通過(guò)調(diào)控GAB2抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[7]。但miR-125a-5p能否通過(guò)其它機(jī)制對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT影響的研究尚不清楚。因此，本研究進(jìn)一步探討miR-125a-5p通過(guò)糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)/Snail信號(hào)通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT的作用，為抑制乳腺癌細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供有價(jià)值的miRNA分子，同時(shí)也為乳腺癌治療提供新的靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 主要材料

抗波形蛋白(vimentin)和上皮鈣黏著蛋白(E-cadherin)單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；抗Snail、p-GSK-3β和GSK-3β抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)購(gòu)自Peprotech；Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen；Transwell小室購(gòu)自 Corning；Matrigel購(gòu)自BD；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；MDA-MB-231、MCF-7和MCF-10A細(xì)胞購(gòu)自ATCC。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)參照先前文獻(xiàn)[8]。按文獻(xiàn)[9]將細(xì)胞分組：(1)MDA-MB-231/NC組，轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒；(2)MDA-MB-231/miR-125a-5p組，轉(zhuǎn)入miR-125a-5p過(guò)表達(dá)質(zhì)粒；(3)MDA-MB-231/miR-125a-5p+Con組，同時(shí)轉(zhuǎn)入miR-125a-5p過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和GAB2過(guò)表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒；(4)MDA-MB-231/miR-125a-5p+GAB2組，同時(shí)轉(zhuǎn)入miR-125a-5p過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和GAB2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。

2.2RT-qPCR實(shí)驗(yàn) RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程參照先前文獻(xiàn)[10]。 PCR條件為95 ℃ 5 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參照，U6的上游引物為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物為5′-CGCTTCACGAAT TTGCGTGTCAT-3′。miR-125a-5p的上游引物為5′-AGCGCGTCCCTGAGACCCTTTAAC-3′，下游引物為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAG-3′。

2.3趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn) 用EGF按4種不同濃度(0、1、10和100 μg/L)分別刺激MDA-MB-231細(xì)胞24 h，Transwell上室中加入細(xì)胞懸液，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，固定、洗滌、Giemsa染色并拍照計(jì)數(shù)，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2.4Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)過(guò)程參照先前文獻(xiàn)[11]。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野拍照計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值為實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2.5核質(zhì)分離 按核質(zhì)分離試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞進(jìn)行提取核蛋白，將所得的蛋白應(yīng)用Western blot檢測(cè)Snail蛋白在各組細(xì)胞中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞抽提蛋白。上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，滴加 I 抗4 ℃過(guò)夜，滴加 II 抗，TBST洗膜，曝光?？贵w配制如下：β-actin(1∶1 000)、Snail(1∶500)、p-GSK-3β(1∶500)、GSK-3β(1∶500)、nucleolin(1∶500)、E-cadherin(1∶500)、vimentin(1∶500)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，兩組間定量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-125a-5p在人正常乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A相比，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7中的miR-125a-5p表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)果表明，miR-125a-5p在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中低表達(dá)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The expression of miR-125a-5p in normal breast epithelial cells and breast cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMCF-10A group.

圖1miR-125a-5p在人正常乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

2 miR-125a-5p在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中的轉(zhuǎn)染效率

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與MDA-MB-231/NC組細(xì)胞相比，MDA-MB-231/miR-125a-5p組細(xì)胞中miR-125a-5p的水平明顯增高(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The transfection efficiency of miR-125a-5p in MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMDA-MB-231/NC group.

圖2miR-125a-5p在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中的轉(zhuǎn)染效率

3 EGF刺激乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的最適濃度為10 μg/L

趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用0、1、10和100 μg/L的4種濃度的EGF刺激MDA-MB-231細(xì)胞后，與未用EGF刺激的MDA-MB-231細(xì)胞相比，其它3種濃度刺激的MDA-MB-231細(xì)胞趨化能力明顯增強(qiáng)，其中，EGF濃度為10 μg/L時(shí)刺激趨化能力最強(qiáng)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3. The optimal stimulation concentration of EGF in MDA-MB-231 cells was at 10 μg/L. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μg/L group.

圖3EGF刺激乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的最適濃度為10μg/L

4 miR-125a-5p抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用EGF刺激24 h后，與MDA-MB-231/NC組細(xì)胞相比，MDA-MB-231/miR-125a-5p組細(xì)胞穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少；而MDA-MB-231/miR-125a-5p+GAB2組細(xì)胞穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)比MDA-MB-231/miR-125a-5p+Con組細(xì)胞明顯增多(P<0.05)，表明miR-125a-5p能明顯降低MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力，見(jiàn)圖4。

5 miR-125a-5p抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，用EGF刺激后，在MDA-MB-231/miR-125a-5p組中，E-cadherin的表達(dá)量比MDA-MB-231/NC組細(xì)胞中的表達(dá)量明顯上調(diào)，而vimentin的表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)；與MDA-MB-231/miR-125a-5p+Con組相比，MDA-MB-231/miR-125a-5p+GAB2組細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)量顯著下調(diào)，vimentin的表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05)，表明miR-125a-5p可有效抑制MDA-MB-231細(xì)胞的EMT，見(jiàn)圖5。

6 miR-125a-5p對(duì)GSK-3β/Snail信號(hào)通路的影響

用10 μg/L EGF刺激乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與MDA-MB-231/NC組細(xì)胞相比，MDA-MB-231/miR-125a-5p組細(xì)胞中的p-GSK-3β和Snail蛋白水平明顯下調(diào)(P<0.05)；而MDA-MB-231/miR-125a-5p+GAB2組細(xì)胞中的p-GSK-3β和Snail蛋白水平與MDA-MB-231/miR-125a-5p+Con組細(xì)胞相比明顯上調(diào)(P<0.05)，表明miR-125a-5p通過(guò)GSK-3β/Snail信號(hào)通路，抑制MDA-MB-231細(xì)胞中Snail的入核，見(jiàn)圖6、7。

Figure 4. miR-125a-5p inhibited the invasion ability of breast cancer cells (Giemsa staining, scale bar=100 μm). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMDA-MB-231/NC;△P<0.05vsMDA-MB-231/mir-125a-5p+Con.

圖4miR-125a-5p抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力

Figure 5. miR-125a-5p inhibited epithelial-mesenchymal transition in breast cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMDA-MB-231/NC(+);△P<0.05vsMDA-MB-231/miR-125a-5p+Con(+).

圖5miR-125a-5p抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

討 論

乳腺癌是由多種復(fù)雜病因引起的異質(zhì)性疾病，涉及到基因和環(huán)境因素，已對(duì)女性的生命和健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[12]。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是引起死亡率劇增的主要原因，其分子機(jī)制一直是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。因此，研究乳腺癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制是治療乳腺癌的重點(diǎn)與難點(diǎn)。

miRNA通過(guò)對(duì)下游靶基因進(jìn)行靶向調(diào)控，間接發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[13]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA的失調(diào)在腫瘤惡性轉(zhuǎn)化和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[14]。

Figure 6. The phosphorylation of GSK-3β in MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMDA-MB-231/NC(+);△P<0.05vsMDA-MB-231/miR-125a-5p+Con(+).

圖6GSK-3β在MDA-MB-231細(xì)胞中的磷酸化水平

Figure 7. The expression levels of Snail protein in the nucleus of MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMDA-MB-231/NC(+);△P<0.05vsMDA-MB-231/miR-125a-5p+Con(+).

圖7Snail蛋白在MDA-MB-231細(xì)胞核中的表達(dá)水平

其中，miR-125是一個(gè)重要的miRNAs家族，其成員已被證實(shí)參與多種腫瘤類型，如肝癌[15]等。先前研究表明，miR-125a-5p可靶向調(diào)控BCL2、BCL2L12和MCL1，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[16]。同時(shí)miR-125a-5p 可負(fù)性調(diào)節(jié)GAB2的表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[9]。本研究中，將 miR-125a-5p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了miR-125a-5p的過(guò)表達(dá)，降低了MDA-MB-231細(xì)胞的體外侵襲能力；而在MDA-MB-231細(xì)胞中，與轉(zhuǎn)染miR-125a-5p+Con質(zhì)粒的細(xì)胞組相比，轉(zhuǎn)染miR-125a-5p+GAB2質(zhì)粒的細(xì)胞組體外侵襲能力明顯增強(qiáng)。

新近研究表明，EMT的發(fā)生在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中非常復(fù)雜，多條信號(hào)通路參與調(diào)控EMT過(guò)程，如Notch[17]、NF-κB[18]、ERK[19]和GSK-3β/Snail信號(hào)通路[20]等。其中，GSK-3β/Snail信號(hào)通路在EMT過(guò)程中至關(guān)重要。GSK-3β在許多參與EMT過(guò)程的信號(hào)通路中具有分子開(kāi)關(guān)的功能，并參與調(diào)節(jié)多種生物功能，如細(xì)胞增殖[21]、分化[22]和遷移[23]等。Snail是EMT的一種重要的誘導(dǎo)物，是E-cadherin的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控器[24]。Zhou等[25]發(fā)現(xiàn)CXCR2/CXCL5可通過(guò)激活GSK-3β/Snail信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的EMT發(fā)生。本研究中，與MDA-MB-231/NC細(xì)胞組相比，在MDA-MB-231/miR-125a-5p細(xì)胞組中GSK-3β的磷酸化水平和Snail轉(zhuǎn)核明顯降低，并引起E-cadherin表達(dá)上調(diào)，vimentin表達(dá)下調(diào)；與MDA-MB-231/miR-125a-5p+Con細(xì)胞組相比，在MDA-MB-231/miR-125a-5p+GAB2細(xì)胞組中GSK-3β的磷酸化水平和Snail轉(zhuǎn)核明顯增加，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，vimentin表達(dá)上調(diào)。

綜上所述，miR-125a-5p可通過(guò)GSK-3β/Snail信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，進(jìn)而抑制乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此，miR-125a-5p有望成為乳腺癌的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，在乳腺癌的治療和預(yù)后方面帶來(lái)新的應(yīng)用。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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