經(jīng)胸肺動脈去神經(jīng)支配術(shù)在肺動脈高壓大鼠模型中的治療作用

黃源，劉一為，項理，邢珺月，蘇展豪，張曉玲，孟健，王佩合，張浩

肺動脈高壓（Pulmonary arterial hypertension，PAH）是以平均肺動脈壓力和肺血管阻力不斷升高，肺血管重構(gòu)為特征的臨床綜合征，持續(xù)升高的肺血管壓力及阻力可導(dǎo)致右心后負(fù)荷增加，最終導(dǎo)致右心衰竭而死亡[1-5]。PAH的發(fā)病機(jī)制尚不明確，近年來有研究表明交感神經(jīng)系統(tǒng)（Sympathetic nervous system,SNS）在肺動脈高壓患者中被激活[6-8]，同時神經(jīng)激素活化一定程度上促進(jìn)了肺動脈高壓的病理生理改變[9]。與此同時，有動物研究表明經(jīng)皮肺動脈交感神經(jīng)消融術(shù)（Percutaneous pulmonary artery denervation，PADN）能消除球囊堵塞左肺動脈遠(yuǎn)端導(dǎo)致的肺動脈高壓[10]，同時也有臨床研究表明通過PADN可以降低PAH患者的平均肺動脈壓力及肺血管阻力，提高患者6分鐘步行距離[11,12]。本研究擬通過對野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠模型行經(jīng)胸肺動脈去神經(jīng)支配術(shù)，探討該手術(shù)是否可以降低肺動脈高壓大鼠的肺動脈壓力，并逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)及右心室肥厚。

1 材料與方法

實驗動物及分組：將24只雄性無特定病原體（Specefic pathogen free，SPF） 級 Sprague Dawley（SD）大鼠，按1:1:1比例隨機(jī)分為對照組、假手術(shù)組及手術(shù)組。以上大鼠均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體重280～300 g。

方法：首先測量各組SD大鼠的平均肺動脈壓等血流動力學(xué)基線參數(shù)，之后對照組給予頸背部皮下一次性注射生理鹽水（60 mg/kg），假手術(shù)組和手術(shù)組給予頸背部皮下一次性注射野百合堿 （60 mg/kg）造模。注射野百合堿4周后，采用右心導(dǎo)管測量各組大鼠平均肺動脈壓等血流動力學(xué)參數(shù)，造模成功后手術(shù)組遂行經(jīng)胸肺動脈去神經(jīng)支配術(shù)，假手術(shù)組只開胸并不進(jìn)行肺動脈去神經(jīng)支配術(shù)。手術(shù)2周后再采用右心導(dǎo)管測量各組大鼠平均肺動脈壓等血流動力學(xué)參數(shù)。之后取心肺組織觀察其顯微形態(tài)學(xué)變化，并測量右心室肥厚指數(shù)（RVHI）。（1）SD大鼠平均肺動脈壓的測量：常規(guī)麻醉大鼠，分離大鼠右側(cè)頸外靜脈，剪口后插入自制2F右心導(dǎo)管，導(dǎo)管通過壓力傳感器與生物機(jī)能實驗系統(tǒng)（PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)，澳大利亞）相連，監(jiān)測壓力變化，在壓力波形的引導(dǎo)下，導(dǎo)管經(jīng)上腔靜脈進(jìn)入右心房、三尖瓣口、右心室，最后進(jìn)入肺動脈干，測定平均肺動脈壓力等血流動力學(xué)參數(shù)。 （2）經(jīng)胸去肺動脈交感神經(jīng)術(shù)過程：常規(guī)麻醉大鼠（腹腔注射戊巴比妥鈉 40 mg/kg），氣管插管，連接動物呼吸機(jī)（ALC-V8S型小動物呼吸機(jī),奧爾科特生物科技公司），設(shè)定呼吸頻率30 次/min，潮氣量10 ml/kg。常規(guī)在大鼠左側(cè)2～3肋間小切口開胸，暴露肺動脈后，剔除肺動脈主干附近結(jié)締組織，之后關(guān)胸，常規(guī)術(shù)后護(hù)理。（3）右心室肥厚指數(shù)測定：處死三組SD大鼠后，剪除心房組織，沿室間隔邊緣分離出右心室（RV），左心室（LV）和室間隔（S），濾紙吸凈組織水分，以電子天平分布稱重RV和（LV+S）質(zhì)量，以公式RV/（LV+S）計算RVHI。 （4）心肺組織形態(tài)學(xué)檢查：分別取其肺組織、心臟組織，對肺組織分別進(jìn)行彈力纖維、膠原、肌纖維三色染色（EVG染色）和肺動脈平滑肌肌動蛋白-內(nèi)皮細(xì)胞染色（SMA-VWF染色）。每只大鼠隨機(jī)選取5張肺組織切片，每張切片隨機(jī)選取10個直徑小于300 μm的肺小動脈，用IPP3D（Image-Pro Plus 3D）圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計算動脈中層壁厚占外徑的百分比（MT%）。心臟組織分別進(jìn)行右心室心肌細(xì)胞膜染色（WGA染色）。每只大鼠隨機(jī)選取5張心臟組織橫斷面切片，每張切片隨機(jī)選取10個右心室心肌細(xì)胞的橫切面視野，用IPP 3D進(jìn)行圖像分析，計算右心室心肌細(xì)胞的橫截面積。 （5）肺動脈交感神經(jīng)的染色，將大鼠肺動脈及周圍結(jié)締組織置于4%的多聚甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋5 μm連續(xù)切片，進(jìn)行酪氨酸羥化酶（abcam公司）染色。

統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)全部采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組內(nèi)前后比較采用配對t檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)變化情況（表1）

研究結(jié)果表明，手術(shù)組和假手術(shù)組在注射野百合堿第4周后，平均肺動脈壓、右心室收縮壓，以及平均右心室壓和肺動脈收縮壓均較注射前（基線水平）顯著升高 （P均＜0.01）；與對照組相比，手術(shù)組及假手術(shù)組這四項血流動力學(xué)指標(biāo)均顯著升高（P均＜0.01），這表明肺動脈高壓大鼠造模成功。此外，手術(shù)組在第6周，即術(shù)后2周時，其平均肺動脈壓、右心室收縮壓，平均左心室壓及肺動脈收縮壓較術(shù)前顯著降低（P＜0.01），而假手術(shù)組術(shù)后與術(shù)前相比持續(xù)升高（P＜0.01）；同時術(shù)后2周時，與假手術(shù)組相比，手術(shù)組平均肺動脈壓、右心室收縮壓，平均左心室壓及肺動脈收縮壓明顯下降（P＜0.01）。

表1 三組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)變化情況（mmHg，±s）

表1 三組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)變化情況（mmHg，±s）

注：與基線水平相比*P＜0．01；與對照組相比△P＜0．01；與同組術(shù)前相比▲P＜0．01；與假手術(shù)組相比 #P＜0．01。1 mmHg=0．133 kPa

項目 對照組(n=8) 假手術(shù)組(n=8) 手術(shù)組(n=8)平均肺動脈壓基線水平 16．8±1．3 16．4±1．2 16．9±1．2第 4 周 (術(shù)前 ) 17．1±1．4 28．6±1．5*△ 29．0±1．9*△第 6周 (術(shù)后二周) 17．4±1．5 35．3±2．5▲ 21．5±1．6▲#右心室收縮壓基線水平 29．0±1．9 29．2±1．5 29．4±2．0第 4 周 (術(shù)前 ) 29．3±1．8 49．9±3．6*△ 50．8±2．9*△第 6周 (術(shù)后二周) 30．0±2．0 60．9±5．2▲ 34．0±1．7▲#平均右心室壓基線水平 12．2±1．1 12．1±1．2 12．0±1．3第 4 周 (術(shù)前 ) 12．0±1．2 20．8±2．0*△ 21．1±1．8*△第 6周 (術(shù)后二周) 12．3±1．4 26．4±1．2▲ 16．0±1．5▲#肺動脈收縮壓基線水平 26．0±1．9 25．7±1．6 26．4±1．4第 4 周 (術(shù)前 ) 26．6±1．6 48．4±3．8*△ 50．6±4．0*△第 6周 (術(shù)后二周) 26．7±1．4 61．0±3．9▲ 31．0±1．7▲#

2.2 三組大鼠肺小動脈中層壁厚占外徑的百分比及形態(tài)學(xué)比較（圖1）

三組大鼠肺小動脈中層壁厚占外徑的百分比（MT%）統(tǒng)計結(jié)果表明：與對照組相比，假手術(shù)組肺小動脈中層平滑肌厚度明顯增厚[（39.7%±3.3%）vs（ 22.3%±1.5%），P＜0.01]； 與 假 手 術(shù) 組 相比，手術(shù)組的肺小動脈中層平滑肌厚度明顯減輕[（30.8%±2.1%） vs （39.7%±3.3%），P＜0.01]。三組大鼠肺小動脈EVG和SMA-VWF染色結(jié)果顯示:對照組肺小動脈管壁清楚菲薄，血管內(nèi)皮扁平；假手術(shù)組肺小動脈管壁增厚，管腔狹窄甚至閉塞，平滑肌細(xì)胞增生，血管內(nèi)皮肥厚，重構(gòu)特征明顯；手術(shù)組肺小動脈管壁清楚，管腔不狹窄，中層平滑肌肥厚減輕（圖1）。

圖1 三組大鼠肺小動脈彈力纖維、膠原、肌纖維三色染色和肺動脈平滑肌肌動蛋白-內(nèi)皮細(xì)胞染色

2.3 三組大鼠右心室肥厚指數(shù)（表2）及右心室心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較（圖2）

研究結(jié)果顯示，與對照組相比，假手術(shù)組右心室心肌細(xì)胞橫截面積和RVHI明顯增大（P均＜0.01）；與假手術(shù)組相比，手術(shù)組右心室心肌細(xì)胞橫截面積明顯減小、RVHI明顯降低（P均＜ 0.01）（表2）。右心室心肌細(xì)胞膜染色顯示，與對照組相比，假手術(shù)組右心室心肌細(xì)胞明顯增大肥厚；與假手術(shù)組相比，手術(shù)組右心室心肌細(xì)胞明顯減小，肥厚程度減輕。

表2 三組大鼠右心室心肌細(xì)胞橫截面積及右心室肥厚指數(shù)的比較（±s）

表2 三組大鼠右心室心肌細(xì)胞橫截面積及右心室肥厚指數(shù)的比較（±s）

注：與對照組相比 *P＜0．01；與假手術(shù)組相比△P＜0．01

項目 對照組(n=8)假手術(shù)組(n=8)手術(shù)組(n=8)右心室肥厚指數(shù) (%) 28．4±1．2 46．7±1．3* 34．4±1．0△右心室心肌細(xì)胞橫截面積 (μ m2) 128±11．0 539±19．0* 230±14．0△

圖2 三組大鼠右心室心肌細(xì)胞膜染色

2.4 肺動脈周圍交感神經(jīng)的酪氨酸羥化酶染色結(jié)果（圖3）

分離大鼠肺動脈及其周圍結(jié)締組織進(jìn)行交感神經(jīng)的酪氨酸羥化酶染色，發(fā)現(xiàn)其肺動脈主干周圍結(jié)締組織中存在大量交感神經(jīng)分布。

圖3 肺動脈周圍交感神經(jīng)的酪氨酸羥化酶染色

3 討論

有臨床研究表明，交感神經(jīng)系統(tǒng)在肺動脈高壓患者中激活[13]，也有研究發(fā)現(xiàn)肺動脈高壓患者血漿去甲腎上腺素水平升高，并且與肺動脈壓、肺血管阻力相關(guān)[14]。交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活可能是肺動脈高壓患者肺血管重塑及右心室功能障礙的促進(jìn)因素[15]。其具體機(jī)制可能是由于患者交感神經(jīng)系統(tǒng)激活，血漿去甲腎上腺素水平增加，增加的去甲腎上腺素通過肺動脈平滑肌上的α1受體介導(dǎo)了肺動脈平滑肌的增殖失調(diào)和肺血管的異常收縮，從而導(dǎo)致肺血管重塑和肺動脈壓力升高，進(jìn)而促成右心室后負(fù)荷增加、右心衰竭。那么，如果經(jīng)胸去除肺動脈周圍交感神經(jīng)，是否會達(dá)到改善肺動脈高壓患者血流動力學(xué)，改善肺血管重構(gòu)及右心室肥厚？本實驗中，我們通過成功構(gòu)建肺動脈高壓大鼠，并實施這一外科手段來印證這一假設(shè)。

首先，本實驗證明在野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠，其肺動脈主干周圍結(jié)締組織中存在大量交感神經(jīng)纖維。而這為肺動脈高壓中交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活提供了基礎(chǔ)。在切除這部分結(jié)締組織后，與假手術(shù)組相比，手術(shù)組的右心室收縮壓、平均肺動脈壓力明顯下降，而且隨著肺動脈壓力的下降，手術(shù)組的肺小動脈中層平滑肌厚度明顯減輕，右心室心肌細(xì)胞橫截面積和RVHI明顯減小，肺血管重構(gòu)和右心室肥厚明顯改善。與經(jīng)皮肺動脈去神經(jīng)術(shù)相比，由于本研究發(fā)現(xiàn)大鼠肺動脈周圍交感神經(jīng)主要分布在肺動脈壁外的結(jié)締組織中，所以經(jīng)胸手術(shù)切除這些富含交感神經(jīng)的結(jié)締組織可以更加徹底地實現(xiàn)肺動脈去神經(jīng)化的目的，加強(qiáng)了手術(shù)效果。此外，該外科干預(yù)手段可避免導(dǎo)管射頻消融對消融處肺動脈內(nèi)皮的炎癥性損傷。

雖然本研究首次證明經(jīng)胸肺動脈去神經(jīng)支配術(shù)可以有效降低野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型的肺動脈壓力，改善其肺動脈重構(gòu)及右心室肥厚，為臨床干預(yù)和治療肺動脈高壓提供了新的潛在方向，但依然存在一些局限性。本實驗中應(yīng)用野百合堿制作了肺動脈高壓大鼠模型，野百合堿通過選擇性損傷肺血管內(nèi)皮，引起慢性血管炎性病變，進(jìn)而導(dǎo)致肺動脈高壓和肺血管重構(gòu)[16]，這一定程度模擬了臨床上特發(fā)性肺動脈高壓的模型，但該手術(shù)對于其它病因所致的肺動脈高壓是否有效仍需進(jìn)一步探索。同時由于缺乏相關(guān)實驗設(shè)備，我們并未檢測三組大鼠心排量和肺動脈阻力，從而沒能全面反映各組大鼠的心功能狀態(tài)和肺血管阻力。此外，這一外科手段對肺動脈高壓大鼠的治療作用，其具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

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