不同重金屬負(fù)荷下黑曲霉的產(chǎn)酸特性及重金屬溶出效果

高云西， 陳金峰， 劉可星

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新肥料資源研究中心實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642； 2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所，廣東廣州 510640)

當(dāng)前，我國受重金屬污染的耕地面積約為2.0×107hm2，約占耕地總面積的1/5，每年因重金屬污染而損失的糧食約為1.0×107t，受污染糧食多達(dá)1.2×107t[1]。有毒重金屬不僅導(dǎo)致土壤肥力與作物產(chǎn)量、品質(zhì)下降，還易引發(fā)地下水污染，并通過食物鏈途徑在植物、動(dòng)物和人體內(nèi)累積，對生態(tài)環(huán)境、食品安全和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，土壤系統(tǒng)中重金屬的污染和防治一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。生物修復(fù)技術(shù)具有修復(fù)效果好、投資小、費(fèi)用低、易于管理與操作、不產(chǎn)生二次污染等特點(diǎn)，因而日益受到人們的重視。生物修復(fù)技術(shù)是重金屬污染土壤修復(fù)的研究熱點(diǎn)，包括植物修復(fù)技術(shù)和微生物修復(fù)技術(shù)。生物溶出技術(shù)是微生物修復(fù)技術(shù)中的一種，是利用微生物的直接作用或其代謝產(chǎn)物的間接作用，產(chǎn)生氧化、還原、絡(luò)合、吸附或溶解作用，將固相中某些不溶性成分分離浸提出來的一種技術(shù)[2]。

生物溶出機(jī)制主要有酸解作用、絡(luò)合作用、氧化還原作用以及生物累積作用，其中以酸解作用為主[3]。常用的微生物主要分為三大類：化能自養(yǎng)細(xì)菌、化能異養(yǎng)細(xì)菌、化能異養(yǎng)真菌[4]，黑曲霉作為化能異養(yǎng)真菌，是在代謝分泌有機(jī)酸方面最具優(yōu)勢的一類[5]，被眾多研究者用于生物溶出各種介質(zhì)(如土壤、飛灰、污泥、礦渣、廢催化劑等)中的重金屬[6-10]。目前的研究主要關(guān)注黑曲霉對重金屬生物溶出的效果及溶出條件的優(yōu)化，如任婉俠等采用分步溶出的方式，利用黑曲霉溶出工業(yè)污染土壤、污灌農(nóng)田土壤中的重金屬，結(jié)果顯示，二步溶出效果明顯[11]；Gholami等優(yōu)化了黑曲霉的溶出條件，提高了廢催化劑中重金屬的溶出率[12]；Zeng等添加芬頓試劑(Fe2+和H2O2組合體系)后提高了黑曲霉對底泥中重金屬的溶出效果[10]。但是，目前的研究對于生物溶出重金屬形態(tài)的變化，特別是對土壤生物溶出過程中的重金屬形態(tài)變化的報(bào)道較少。研究生物溶出土壤重金屬及其過程中的重金屬形態(tài)變化，有利于深入了解土壤重金屬的生物溶出機(jī)制，并對于了解重金屬在土壤中的重金屬活性、生物毒性和遷移規(guī)律具有重要意義[10]。

因此，本研究以振蕩搖床培養(yǎng)方式，研究不同碳酸鎘或土壤添加量對黑曲霉溶出重金屬鎘(Cd)的影響，以及黑曲霉溶出土壤重金屬過程中Cd的形態(tài)變化，探討黑曲霉溶出土壤重金屬的可能機(jī)制，為生物溶出土壤重金屬技術(shù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌種：黑曲霉，購自廣東省微生物菌種保藏中心。固體培養(yǎng)基：PDA斜面，主要原料為200 g馬鈴薯(去皮)、20 g蔗糖、18 g瓊脂，加蒸餾水至1 000 mL，自然pH值。液體培養(yǎng)基的配制：100 g蔗糖，0.5 g磷酸二氫鉀，1.5 g硝酸鈉，0.025 g 七水硫酸鎂，0.025 g氯化鉀，1.6 g酵母粉，加蒸餾水至1 000 mL，自然pH值。

固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌20 min。

CdCO3，分析純。含Cd土壤，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所提供，土壤風(fēng)干后，研磨過20目篩保存?zhèn)溆?，其基本理化指?biāo)如下：pH值5.55，有機(jī)質(zhì)含量 11.82 g/kg，全氮含量0.161 g/kg，全磷含量34.57 g/kg，全鉀含量18.92 g/kg，Cd含量12.24 mg/kg。

1.2 方法

(1)黑曲霉對CdCO3的溶出試驗(yàn)。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，具體處理內(nèi)容如下：CK0，1 mL孢子溶液，不加碳酸鎘；T1處理，1 mL孢子溶液，7.67 mg碳酸鎘；T2處理，1 mL孢子溶液，15.34 mg碳酸鎘。

分別稱取7.67、15.37 mg CdCO3樣品加入裝有100 mL已滅菌的液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，加入1 mL孢子溶液，孢子數(shù)為1.63×107個(gè)/mL，空白對照中加入1 mL無菌水，搖勻后置于往復(fù)式搖床中，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng) 5 d。將樣品于5 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。采用原子吸收法測定濾液Cd含量，用高效液相色譜法測定檸檬酸、草酸含量[11]。

高效液相色譜(伍豐LC100，上海)分析的具體參數(shù)如下：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18，250 mm×4.6 mm；流動(dòng)相為5 g/L Na2HPO4-H3PO4(pH值=2.8，用磷酸調(diào)節(jié))；流速為0.6 mL/min；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；DAD檢測器；波長為215 nm。

(2)黑曲霉對含Cd土壤重金屬的溶出試驗(yàn)。設(shè)3個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，具體的處理如下：CK，1 mL孢子溶液，不加土壤；Ta，1 mL孢子溶液，加5.84 g土壤；Tb，1 mL孢子溶液，加11.68 g土壤；Tc，1 mL孢子溶液，加23.36 g土壤。

分別稱取5.84、11.68、23.36 g滅菌土壤樣品加入裝有100 mL已滅菌的液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，加入1 mL孢子溶液，孢子數(shù)為1.80×107個(gè)/mL，搖勻后置于往復(fù)式搖床中于30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

將樣品在5 000 r/min離心10 min，用0.45 μm濾膜過濾，得上清液，測定pH值；用原子吸收法測定上清液中Cd含量，測得的Cd含量與土壤Cd總含量的比值即為金屬溶出率[12]；將沉淀物在80 ℃烘干至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量，然后于 600 ℃ 灼燒2 h后再次稱質(zhì)量，計(jì)算菌體含量[12]；將沉淀物及原土壤研磨過100目篩，用Tessier連續(xù)提取分級程序法分析測定Cd的形態(tài)變化[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同含量CdCO3對黑曲霉有機(jī)酸分泌量和重金屬溶出率的影響

由表1可見，黑曲霉的檸檬酸分泌量在CK0與T1、T2處理間存在顯著差異，但T1、T2處理差異不明顯，說明黑曲霉生產(chǎn)檸檬酸的量與CdCO3有關(guān)，發(fā)酵液中檸檬酸與CdCO3反應(yīng)消耗部分檸檬酸，且Cd對黑曲霉生長產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致T1、T2處理檸檬酸含量減少。而發(fā)酵液中T2處理的草酸含量與CK0、T1存在顯著差異，T2處理累積草酸量較多。表1中檸檬酸量表現(xiàn)為T1處理>T2處理，而Cd2+溶出率表現(xiàn)為T2處理>T1處理，說明可能由于檸檬酸與CdCO3反應(yīng)，T2處理消耗較多的檸檬酸，從而使T2處理的檸檬酸含量減少，Cd2+溶出率增加；另外，CO32-與H+反應(yīng)，使發(fā)酵液酸性下降，隨著CdCO3添加量的增加，發(fā)酵液的緩沖性加大，因此發(fā)酵液的pH值表現(xiàn)為T2處理>T1處理>CK0。研究表明，檸檬酸和草酸在溶出土壤重金屬過程中，檸檬酸對多種重金屬都有明顯的浸出效果，而草酸與重金屬形成的螯合物穩(wěn)定性較差[13-16]。另外，黑曲霉產(chǎn)生有機(jī)酸的種類隨培養(yǎng)條件(如碳源和氮源種類、重金屬濃度、溫度以及pH值等)的改變而改變[17]。當(dāng)發(fā)酵環(huán)境pH值為2.0～4.0時(shí)，易產(chǎn)生檸檬酸[3]，而當(dāng)pH值高于4.0時(shí)，會(huì)使黑曲霉改變代謝途經(jīng)，導(dǎo)致菌體累積草酸等[7]。由于溶液中添加了CdCO3，而CdCO3是碳酸鹽類，容易與溶液中的H+發(fā)生反應(yīng)，改變了發(fā)酵環(huán)境的pH值，使得T1、T2處理累積草酸量較多。

表1 不同發(fā)酵液中的有機(jī)酸含量、pH值、Cd2+溶出率

注：表中所示數(shù)值為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母代表經(jīng)Duncan’s多重比較，差異顯著(α=0.05，n=3)。下表同。

2.2 黑曲霉對土壤中Cd的溶解效果以及形態(tài)變化

2.2.1 發(fā)酵液pH值、重金屬溶出率及菌體干質(zhì)量 由表2可知，發(fā)酵液中CK處理的菌體干質(zhì)量、pH值與其他處理差異顯著，說明不同土壤添加量影響黑曲霉的生長。Tb處理的菌體干質(zhì)量、pH值與Ta、Tc處理也基本存在顯著差異(除Tb處理與Ta處理的pH值差異不顯著)，但Ta處理與Tc處理之間差異不明顯，Cd2+溶出率排序?yàn)門b處理>Ta處理>Tc處理，說明發(fā)酵液中Cd2+溶出率與黑曲霉菌體含量、溶液pH值、土壤添加量等有關(guān)，且當(dāng)溶液pH值為3.11、土壤含量為11.68 g時(shí)，溶出效果明顯。楊潔等研究表明，當(dāng)添加飛灰量較高(100 g/L)時(shí)，黑曲霉菌體生長緩慢，導(dǎo)致檸檬酸等分泌量減少，影響Cd2+的溶出效果[17]。另外，隨著土壤添加量增加，發(fā)酵液pH值下降的緩沖性增大，也導(dǎo)致Cd2+的溶出率降低，因?yàn)樯锪転V修復(fù)主要依賴于酸解機(jī)制[11]。

表2 不同發(fā)酵液的pH值、重金屬溶出率及菌體干質(zhì)量

2.2.2 溶出前后土壤Cd形態(tài)變化 由表3可見，黑曲霉對土壤重金屬Cd的可交換態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)、氧化物結(jié)合態(tài)溶出效果較為顯著，但對有機(jī)結(jié)合態(tài)、殘?jiān)鼞B(tài)淋溶效果不明顯。5種形態(tài)中，可交換態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)對環(huán)境條件變化比較敏感，可交換態(tài)在中性環(huán)境中即可釋放出來，而碳酸鹽結(jié)合態(tài)對pH值最敏感，當(dāng)pH值下降時(shí)易重新釋放出來，氧化物結(jié)合態(tài)在還原條件下容易溶出，有機(jī)結(jié)合態(tài)則在氧化條件下容易釋放出來[18]，由表3還可見，氧化物結(jié)合態(tài)的溶出量與土壤原樣相比，存在顯著差異，而殘?jiān)鼞B(tài)差異不明顯，說明重金屬Cd的溶出是在還原條件下進(jìn)行的。殘?jiān)鼞B(tài)重金屬存在于礦物晶格中，性質(zhì)穩(wěn)定，在自然條件下不易溶出[19]，因此黑曲霉對殘?jiān)鼞B(tài)Cd的溶出效果較差。

表3 土壤中Cd的形態(tài)分布

3 討論與結(jié)論

(1)黑曲霉分泌的檸檬酸、草酸含量及Cd2+溶出率與CdCO3添加量有關(guān)。隨著CdCO3添加量增加，檸檬酸的累積量減少，草酸的累積量提高，Cd2+溶出率增加。(2)不同土壤添加量對黑曲霉菌體生長、發(fā)酵液pH值以及Cd溶出率有不同的影響，土壤添加量較高時(shí)，黑曲霉菌體含量和Cd溶出率下降，土壤添加量為11.68 g的溶出效果最優(yōu)。(3)黑曲霉對土壤重金屬Cd的可交換態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)、氧化物結(jié)合態(tài)溶出效果較為明顯，但對性質(zhì)穩(wěn)定的有機(jī)結(jié)合態(tài)、殘?jiān)鼞B(tài)溶出效果不明顯。

參考文獻(xiàn)：

[1]Wu G，Kang H B，Zhang X Y，et al. A critical review on the bio-removal of hazardous heavy metals from contaminated soils：issues，progress，eco-environmental concerns and opportunities[J]. J Hazard Mater，2010，174(1/2/3)：1-8.

[2]任婉俠，李培軍，何 娜，等. 異養(yǎng)微生物在金屬生物淋濾技術(shù)中的應(yīng)用[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2007，26(11)：1835-1841.

[3]Wu H Y，Ting Y P. Metal extraction from municipal solid waste (MSW) incinerator fly ash - Chemical leaching and fungal bioleaching[J]. Enzyme and Microbial Technology，2006，38(6)：839-847.

[4]楊 潔，蔡體久，汪群慧，等. 直接與間接生物淋濾法去除城市生活垃圾焚燒飛灰中重金屬的研究[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008(增刊1)：267-271.

[5]Burgstaller W，Schinner F. Leaching of metals with fungi[J]. Journal of Biotechnology，1993，27(2)：91-116.

[6]Bosshard P P，Bachofen R A，Brandl H. Metal leaching of fly ash from municipal waste incineration byAspergillusniger[J]. Environmental Science and Technology，1996，30(10)：3066-3070.

[7]Wasay S A，Barrington S F，Tokunaga S. UsingAspergillusnigerto bioremediate soils contaminated by heavy metals[J]. Bioremediation Journal，1998，2(3)：183-190.

[8]Mulligan C N，Kamali M，Gibbs B F. Bioleaching of heavy metals from a low-grade mining ore usingAspergillusniger[J]. Journal of Hazardous Materials，2004，110(1/2/3)：77-84.

[9]Aung K M M，Ting Y P. Bioleaching of spent fluid catalytic cracking catalyst usingAspergillusniger[J]. Journal of Biotechnology，2005，116(2)：159-170.

[10]Zeng X，Wei S，Sun L，et al. Bioleaching of heavy metals from contaminated sediments by theAspergillusnigerstrain SY1[J]. Journal of Soils and Sediments，2015，15(4)：1029-1038.

[11]任婉俠，李培軍，李曉軍. 黑曲霉產(chǎn)酸淋濾去除污染土壤中的重金屬[J]. 中國環(huán)境科學(xué)，2008，28(8)：736-741.

[12]Gholami R M，Mousavi S M，Borghei S M. Process optimization and modeling of heavy metals extraction from a molybdenum rich spent catalyst byAspergillusnigerusing response surface methodology[J]. Journal of Industrial and Engineering Chemistry，2012，18(1)：218-224.

[13]Kim J O，Lee Y W，Chung J. The role of organic acids in the mobilization of heavy metals from soil[J]. Ksce Journal of Civil Engineering，2013，17(7)：1596-1602.

[14]Zaleckas E，Paulauskas V，Sendzikiene E. Fractionation of heavy metals in sewage sludge and their removal using low-molecular-weight organic acids[j]. Journal of Environmental Engineering and Landscape Management，2013，21(3)：189-198.

[15]馬云龍，曾清如，胡 浩，等. 低分子有機(jī)酸對土壤中重金屬的解吸及影響因素[J]. 土壤通報(bào)，2008，39(6)：1419-1423.

[16]胡 浩，潘 杰，曾清如，等. 低分子有機(jī)酸淋溶對土壤中重金屬Pb Cd Cu和Zn的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27(4)：1611-1616.

[17]楊 潔，汪群慧，王 琪，等. 垃圾焚燒飛灰濃度對黑曲霉生長及重金屬生物淋濾效果的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)，2008，29(3)：825-830.

[18]魏俊峰，吳大清，彭金蓮，等. 廣州城市水體沉積物中重金屬形態(tài)分布研究[J]. 土壤與環(huán)境，1999(1)：10-14.

[19]李宇慶，陳 玲，仇雁翎，等. 上海化學(xué)工業(yè)區(qū)土壤重金屬元素形態(tài)分析[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2004，13(2)：154-155.