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    mTOR抑制劑對胞內(nèi)李斯特菌繁殖的影響

    2018-06-29 05:07:02印雙紅張俊波
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年11期
    關(guān)鍵詞:雷帕微血管內(nèi)皮細(xì)胞

    印雙紅, 張俊波

    (1.銅仁學(xué)院大健康學(xué)院,貴州銅仁 554300; 2.銅仁學(xué)院農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院/銅仁市文化科技產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究中心,貴州銅仁 554300;3.浙江大學(xué)動物科技學(xué)院,浙江杭州 3100204)

    單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,簡稱Lm)是一種人畜共患的革蘭陽性致病菌,同時(shí)也是四大食源性病原體之一??稍诿庖吖δ艿拖碌膫€(gè)體中,如老年人、孕婦、新生兒等,引起腦膜炎、敗血癥等嚴(yán)重的感染性疾病,免疫力正常人群,在食入一定量Lm污染的食品后,也可能會出現(xiàn)發(fā)熱性胃腸炎癥狀[1]。雖然該病的發(fā)病率不高,但是死亡率可高達(dá)20%~30%,危害很大,已成為全球性疾病,上世紀(jì)80年代歐美國家不斷發(fā)生單核細(xì)胞增生李斯特菌引起的食物中毒事件,該病原菌才逐步受到人們的關(guān)注。單核細(xì)胞增生李斯特菌感染過程和致病機(jī)制成為研究的重點(diǎn)之一[2-3],Lm是兼性細(xì)胞內(nèi)生存的病原菌,既能感染吞噬細(xì)胞也能感染非吞噬細(xì)胞,如巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等,并在細(xì)胞中生長、增殖進(jìn)而在細(xì)胞間進(jìn)行傳播[4]。其感染過程可以分為4個(gè)階段:入侵、逃逸吞噬泡、增殖以及在細(xì)胞與細(xì)胞之間傳播[5-6]。

    哺乳動物雷帕霉素(Rapamycin)靶蛋白(mTOR)最早作為酵母雷帕霉素靶蛋白的同源體被發(fā)現(xiàn),mTOR通過調(diào)節(jié)mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯、凋亡、自噬以及細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞大小等方式,在細(xì)胞生長、增殖、代謝等方面發(fā)揮重要作用。近來mTOR作為免疫反應(yīng)的中心調(diào)控因子正在被關(guān)注,mTOR作為一個(gè)信號級聯(lián)的中央節(jié)點(diǎn)指導(dǎo)集成免疫微環(huán)境中的各種環(huán)境信號的輸入,調(diào)節(jié)各種免疫細(xì)胞,包括T細(xì)胞、NK細(xì)胞、APC等各種免疫細(xì)胞的分化發(fā)育,影響其功能活性[7-8]。mTOR與許多疾病密切相關(guān),然而與李斯特菌病關(guān)系如何,目前尚不清楚,本研究著重探討mTOR抑制劑對李斯特菌存活的影響,以期為揭示Lm致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株和細(xì)胞

    單核細(xì)胞增生李斯特菌(Lm)和小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 主要試劑

    胎牛血清和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自GIBCO公司;酵母提取物、蛋白胨購自上海生工生物工程有限公司;Triton X-100 細(xì)胞裂解液、MTT試劑盒和DMSO購自北京索萊寶科技有限公司;Caspase-1活性檢測試劑盒和雷帕霉素抑制劑購自碧云天公司;小鼠IL-6、IFN-γ和IL-1βELISA試劑盒均購自上海依科賽生物制品有限公司。

    1.3 主要儀器

    生物安全柜;超純水處理系統(tǒng);CO2培養(yǎng)箱;低溫高速離心機(jī);全自動酶標(biāo)檢測儀,全自動高壓蒸汽滅菌鍋。

    1.4 MTT試驗(yàn)

    (1)收集對數(shù)期的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液,以每孔103~104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔總體積為200 μL,邊緣孔用無菌的PBS填充。

    (2)置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6~24 h使細(xì)胞貼壁。

    (3)將不同濃度的抑制劑雷帕霉素(5、10、20、50 nmol/L)與細(xì)胞共同孵育,0.1% DMSO處理的細(xì)胞作對照,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

    (4)置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16~48 h,倒置顯微鏡下觀察。

    (5)小心吸取上清,加入180 μL新鮮培養(yǎng)液,再加入 20 μL MTT(5 mg/mL,即0.5% MTT)溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

    (6)棄去上清,每孔加入150 μL DMSO溶液,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶充分溶解,在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度。

    (7)同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、DMSO溶解液),對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、DMSO溶解液),每組設(shè)定3復(fù)孔,細(xì)胞存活率=(D試驗(yàn)組-D空白組)/(D對照組-D空白組)×100%。

    1.5 實(shí)時(shí)定量PCR

    從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站GenBank上查找公布相關(guān)基因設(shè)計(jì)引物,引物序列見表1。實(shí)時(shí)定量PCR采用20 μL體系,實(shí)時(shí)定量PCR采用20 μL體系,PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。每組細(xì)胞每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞做3個(gè)重復(fù),試驗(yàn)完成后用2-ΔΔCT法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

    表1 相關(guān)基因引物設(shè)計(jì)

    1.6 Lm侵染小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

    抑制劑雷帕霉素與小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞作用1 h,將30 μL的單克隆Lm接種到20 mL液體培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)24 h。多次收集菌液于1.5 mL EP管中,12 000 r/min 離心2 min;用PBS洗脫菌體3次,懸浮菌體,將其調(diào)整為5.0×107個(gè)/mL。以50 ∶1(細(xì)菌個(gè)數(shù) ∶細(xì)胞個(gè)數(shù))的比例,用Lm感染細(xì)胞,并將其置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),在侵染1 h之后每孔用PBS洗滌3次,加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

    1.7 ELISA檢測細(xì)胞因子

    小鼠ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作見操作步驟。抑制劑雷帕霉素(20 nmol/L)與小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞作用1 h,Lm感染細(xì)胞,將細(xì)菌 ∶細(xì)胞按50 ∶1的比例感染細(xì)胞,并將感染的細(xì)胞繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。僅用Lm感染的細(xì)胞作為對照組。在12 h和24 h收集細(xì)胞上清液,按照說明書,完成IL-6、IFN-γ和IL-1β的ELISA檢測,試驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    使用SPSS 17.0驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 雷帕霉素對小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響

    不同濃度抑制劑雷帕霉素(5、10、20、50 nmol/L)與細(xì)胞作用48 h后,收集細(xì)胞,利用MTT方法檢測細(xì)胞活性,結(jié)果表明,當(dāng)抑制劑雷帕霉素濃度為5、10、25 nmol/L不影響細(xì)胞活性(圖1),而在50 nmol/L時(shí)細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05),表明雷帕霉素對細(xì)胞活性影響具濃度依賴性。

    2.2 雷帕霉素對Lm胞內(nèi)存活的影響

    不同濃度(5、10、20 nmol/L)雷帕霉素與細(xì)胞孵育1 h,然后,將Lm感染細(xì)胞24 h,裂解細(xì)胞,通過菌斑計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn),胞內(nèi)Lm數(shù)量隨著雷帕霉素濃度的增加而減少,Lm+雷帕霉素組細(xì)菌數(shù)量顯著低于對照組(P<0.05);同一濃度雷帕霉素(20 nmol/L)與細(xì)胞孵育1 h,將Lm感染細(xì)胞4、12、24、48 h點(diǎn),檢測胞內(nèi)菌數(shù),結(jié)果顯示,在12、24、48 h時(shí),雷帕霉素處理細(xì)胞中Lm的lgCFU值顯著低于對照組(P<0.05),而在 4 h 與對照組無顯著差異(圖2),表明雷帕霉素抑制胞內(nèi)菌數(shù)與其濃度和感染時(shí)間相關(guān)。

    2.3 雷帕霉素對Lm介導(dǎo)細(xì)胞因子水平的影響

    雷帕霉素與細(xì)胞作用1 h,然后,用Lm感染細(xì)胞,未經(jīng)雷帕霉素處理的細(xì)胞作為對照組,分別在12 h和24 h收集細(xì)胞上清液,利用ELISA檢測IL-6和IFN-γ水平,結(jié)果顯示,雷帕霉素處理組誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-6和IFN-γ水平極顯著高于對照組(P<0.01)。結(jié)果表明,雷帕霉素誘導(dǎo)Lm介導(dǎo)IL-6和IFN-γ水平,從而提高抵抗Lm感染的細(xì)胞免疫(圖3)。

    2.4 雷帕霉素對Lm介導(dǎo)caspase-1水平的影響

    本研究先用雷帕霉素與細(xì)胞孵育1 h,然后,用Lm感染細(xì)胞12 h和24 h,用試劑盒檢測caspase-1活性。結(jié)果顯示,Lm+雷帕霉素組細(xì)胞caspase-1的D405 nm值都極顯著高于對照組細(xì)胞(P<0.01),結(jié)果表明,雷帕霉素可提高Lm介導(dǎo)的caspase-1活性,從而誘導(dǎo)Lm介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖4)。

    2.5 雷帕霉素對Lm介導(dǎo)細(xì)胞炎性體的影響

    為進(jìn)一步證實(shí)Lm是否能夠激活該細(xì)胞的炎性體,并檢測雷帕霉素對Lm介導(dǎo)細(xì)胞炎性體的影響,本研究先用雷帕霉素與細(xì)胞孵育1 h,然后,用Lm感染細(xì)胞24 h,用ELISA試劑盒檢測IL-1β的含量,用qRT-PCR檢測NLRP3的mRNA相對水平變化。結(jié)果(圖5)顯示,Lm組的IL-1β水平和NLRP3的mRNA水平顯著高于對照組Control正常細(xì)胞(P<0.01),并且,Lm+雷帕霉素組細(xì)胞IL-1β水平和NLRP3的mRNA水平顯著高于對照組細(xì)胞(P<0.01),結(jié)果表明,Lm能夠激活該細(xì)胞的炎性體,雷帕霉素可增強(qiáng)Lm介導(dǎo)的細(xì)胞炎性體水平。

    3 討論

    mTOR在調(diào)節(jié)帽依賴的翻譯起始中扮演重要角色,并通過調(diào)控細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成作用而成為細(xì)胞生長和增殖中的重要調(diào)節(jié)器。mTORC1通過生長因子、能量水平氨基酸來調(diào)控生長,它的活性在許多疾病中都被下調(diào)[9]。結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體通過調(diào)控Rheb-GTP的水平變化向mTORC1傳遞生長因子和能量信號[9]。當(dāng)TSC失活,Rheb-GTP的水平增高,使mTORC1抑制劑FKBP38離開mTORC1[10],導(dǎo)致mTORCl活化,從而保證帽依賴翻譯,維持正常細(xì)胞周期進(jìn)程。但最近有研究報(bào)道,在哺乳動物中,mTORC1通過其下游效應(yīng)器4EBP1調(diào)控細(xì)胞增殖而非細(xì)胞生長,而在低等真核生物中,兩者可同時(shí)被調(diào)控[11]。也有研究指出,mTORC1通過感受能量因子活化的關(guān)鍵是磷脂酶D介導(dǎo)產(chǎn)生的磷脂酸而非TSC[12]。相比mTORC1,mTORC2的功能則研究較少。Jacinto等報(bào)道,mTORC2可調(diào)控細(xì)胞骨架肌動蛋白的形成[13]。Akt有2個(gè)磷酸化位點(diǎn):serine473和threonine308[14],其中serine473是mTORC2唯一的底物。mTORC2通過serine473磷酸化Akt,從而活化mTORC1來發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[13],故mTORC2可認(rèn)為是mTORC1的上游信號分子。

    細(xì)胞免疫是胞內(nèi)菌感染的有效免疫形式。Lm的天然免疫應(yīng)答涉及各種細(xì)胞和細(xì)胞因子及其之間的相互作用。研究表明,單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及髓樣DC中的PI3K-mTOR通路對TLR信號是至關(guān)重要的[15]。在對體外培養(yǎng)的老鼠DC研究發(fā)現(xiàn),抑制mTOR后可以抑制全部的炎癥反應(yīng)。然而在剛分離的人單核細(xì)胞和初始mDC內(nèi),刺激TLR不改變TSC-mTOR通路下游的PI3K對炎癥反應(yīng)的調(diào)控。雷帕霉素處理后的炎癥反應(yīng)受轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和STAT3調(diào)控。在人單核細(xì)胞中,抑制mTOR會提高經(jīng)由NF-κB的炎性細(xì)胞因子 IL-12p40、IL-12p70、IL-23、IL-6以及TNF-α的生成,但是會阻斷通過STAT3的IL-10的釋放。研究顯示,NF-κB和STAT3是受mTOR獨(dú)立調(diào)控。在炎癥反應(yīng)調(diào)控相類似的活體試驗(yàn)中,抑制mTOR后通過提高IL-12的生成可以保護(hù)老鼠抵抗Lm的致命感染。雷帕霉素處理處在TLR興奮期的單核細(xì)胞和DC,能夠增強(qiáng)T細(xì)胞的激活,促進(jìn)IFN-γ、IL-17的生成[16]。在感染初期,其中IL-1、IL-6、TNF-α和 IFN-γ在抗Lm過程中發(fā)揮重要作用[17]。本研究表明,PI3K抑制劑雷帕霉素可以提高胞內(nèi)Lm介導(dǎo)的IL-6和IFN-γ的分泌,有助于細(xì)胞抵抗Lm的感染,因此,揭示了PI3K抑制劑雷帕霉素調(diào)控Lm存活的分子機(jī)制。

    靶細(xì)胞表面的死亡受體通過與配體結(jié)合,可進(jìn)一步激活FADD進(jìn)而激活下游的caspase-8或caspase-10,啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)。報(bào)道還表明,mTOR通路在TRAIL介導(dǎo)產(chǎn)生的多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。Liu等報(bào)道m(xù)TOR抑制劑雷帕霉素通過抑制Na/K-ATPase活性可以直接活化TNFa誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生后的Caspase-9的活性,從而加速細(xì)胞凋亡[18]。Barbone等[19]報(bào)道在實(shí)體瘤細(xì)胞中,mTOR及其下游信號分子S6K基因敲除后可以顯著提高TRAIL介導(dǎo)產(chǎn)生的活化caspase-8,證明了mTOR通路通過調(diào)控死亡受體通路來抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此,可以看出,mTOR信號通路可以直接或間接作用于死亡受體或相應(yīng)配體,從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但根據(jù)細(xì)胞類型的不同,其作用機(jī)制也不一樣。

    炎性體的活化在病原感染過程中受到嚴(yán)密調(diào)控,過度的活化會造成大量的細(xì)胞死亡和組織損傷。炎性體的活化需要第一信號和第二信號共同調(diào)節(jié)[20-21],炎性體通過第一信號,上調(diào)炎性體各成員基因以及IL-1β前體的轉(zhuǎn)錄;通過第二信號炎性體各個(gè)成員裝配形成多蛋白復(fù)合物。炎性體活化后主要促進(jìn)IL-1β、IL-18等促炎癥細(xì)胞因子的分泌和介導(dǎo)caspase-1依賴的細(xì)胞死亡“pyroptosis”,進(jìn)而調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng),抵抗并清除入侵的病原微生物。IL-1β能激活T細(xì)胞介導(dǎo)的Th1、Th17細(xì)胞免疫以及B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫等適應(yīng)性免疫[22]。許多胞內(nèi)寄生菌的毒力因子被NLPR 1、NLRP3等胞內(nèi)PRRs所識別,介導(dǎo)相應(yīng)的炎性體活化。在Lm感染引起的NLRP3炎性體活化的過程中,鳥苷酸結(jié)合蛋白5能促進(jìn)ASC的寡聚化,從而促進(jìn)炎性體的形成。炎性體活化后,促炎細(xì)胞因子IL-1β的成熟和分泌能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng),這對于抵抗入侵的病原都具有重要意義[23]。目前Lm主要能活化單核巨噬細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞的NLRP3炎性體[24]、AIM2炎性體以及NLRC4炎性體,而在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上,Lm能活化的炎性體形式尚未見報(bào)道,結(jié)果顯示,Lm能活化腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎性體,并且,抑制劑雷帕霉素可調(diào)控Lm介導(dǎo)的細(xì)胞炎性體水平。

    本研究發(fā)現(xiàn)抑制劑雷帕霉素可顯著降低Lm在小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的存活,由于mTOR信號通路與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切,因此,推測雷帕霉素主要通過mTOR信號通路調(diào)控Lm介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,從而調(diào)控了Lm在細(xì)胞內(nèi)的存活,研究表明雷帕霉素在調(diào)控Lm胞內(nèi)的生存繁殖發(fā)揮重要作用,為揭示Lm致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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