豌豆根瘤菌高效菌株的篩選

潘亭亭， 王 樂， 姚紅麗， 劉忠寬， 曹衛(wèi)東， 劉朋飛， 劉曉云

(1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071002；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究所，河北石家莊 050051； 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081)

豌豆(PisumsativumL.)多為一年生或多年生的攀緣或矮生草本植物，是家喻戶曉的豆類糧食作物，又名蜜豆、青豆等。豌豆因富含蛋白質(zhì)、脂肪、粗纖維以及維生素B1、維生素B2、維生素C等多種營養(yǎng)成分，具有豐富多樣的使用價(jià)值[1-2]，其栽培面積和產(chǎn)量僅次于大豆、花生和菜豆[3]。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，簡稱FAO)統(tǒng)計(jì)資料，2005年全世界有88個(gè)國家生產(chǎn)干豌豆，栽培面積約為658萬hm2，總產(chǎn)量約為 1 126萬t[4]。中國是世界上第三大干豌豆生產(chǎn)國和第二大青豌豆生產(chǎn)國，干豌豆生產(chǎn)主要分布在云貴川、江浙、湖北和北方一些省(市)[5]。但是我國與世界豌豆主產(chǎn)國相比，土壤產(chǎn)率較低[2]，如何提高我國豌豆的產(chǎn)量和質(zhì)量成為當(dāng)今亟須解決的難題。除選用良種及改進(jìn)栽培技術(shù)是提高豌豆產(chǎn)量的重要途徑[6]外，豌豆生產(chǎn)中的肥料合理施用也是比較關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。豌豆可以與相應(yīng)的根瘤菌形成共生關(guān)系從而將空氣中的游離態(tài)氮固定，滿足自身營養(yǎng)所需，所以基本不需要施用氮素或少施氮肥。自然生長的豌豆具有根瘤著生，但其數(shù)量有限，而且固氮能力有限。接種適宜的根瘤菌可以大大提高豌豆的結(jié)瘤固氮能力，為自身生長提供必需的氮素營養(yǎng)，達(dá)到增產(chǎn)的目的[7-9]。豌豆根瘤菌的多樣性，為豌豆生產(chǎn)提供了可備選擇的根瘤菌資源[10-11]。Palmer等研究表明，可耕種的土壤中的豌豆根瘤菌多樣性比草地中的多樣性要高[12]。但是，根瘤菌的共生固氮效率既與參與固氮的根瘤菌和植物基因有關(guān)，又受到生態(tài)環(huán)境(如土壤環(huán)境與肥力、pH值、溫度等)的影響[13]。因此，篩選與植株匹配性較高、能高效固氮的菌株尤為關(guān)鍵。中國科學(xué)院南京土壤研究所根瘤菌組等通過豌豆根瘤菌拌種，發(fā)現(xiàn)人工接種根瘤菌能夠明顯改善豌豆的結(jié)瘤情況；一些根瘤菌菌株R12、R20、R21、ACCC16101與ACCC16103，可以顯著增加豌豆根瘤數(shù)量、根生物量及植株地上部分干質(zhì)量，并獲得接種用的菌株[14-16]。張虎天等通過對(duì)豌豆-玉米間作體系接種根瘤菌，使土壤含氮量和植株氮素積累量最大，分別增加37.4%和17.4%，并提高了體系中作物根際的細(xì)菌數(shù)量[17]。本研究以滄州南大港鹽堿土為植株主要生長介質(zhì)，以花葉豌豆為研究對(duì)象，旨在篩選出與花葉豌豆高效固氮且耐鹽堿的根瘤菌菌株，提高豌豆產(chǎn)量，改善土壤營養(yǎng)狀況。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤為鹽堿土，采自河北省滄州市南大港六分區(qū)27隊(duì)，土壤理化性質(zhì)見表1。

供試作物為花葉豌豆(PisumsativumL.)，由河北省農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究所劉振宇贈(zèng)與。供試菌種引自河北大學(xué)微生物多樣性研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，共18株。

YMA固體培養(yǎng)基的配方：K2HPO40.25 g/L，KH2PO40.25 g/L，甘露醇10 g/L，酵母粉0.8 g/L，MgSO40.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，瓊脂粉14 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng) 將供試菌種接種在YMA固體培養(yǎng)基上活化，然后將菌種接種到Y(jié)MA固體斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d，用100 mL無菌水洗下菌體，裝進(jìn)無菌三角瓶中搖床振蕩15 min，利用分光光度計(jì)測(cè)其菌懸液的D600 nm。當(dāng)D600 nm>0.5后進(jìn)行接種。

1.2.2 土壤處理 將土壤壓碎去雜，按照V土壤∶V沙=4 ∶1，將土壤和沙充分混勻，稱取1.0 kg置于種植花盆(20 cm口徑)中，種植前適量澆水，使土壤浸潤，保持一定濕度。

表1 土壤理化性質(zhì)

1.2.3 種子處理 挑選飽滿未破損的豌豆種子，依次用95%乙醇浸泡5 min，無菌水沖洗5～7次；用濃硫酸浸泡 2 min，無菌水沖洗5～7次；用5%次氯酸鈉浸泡5 min，無菌水沖洗5～7次后，將種子均勻放置于裝有潤濕濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，28 ℃避光發(fā)芽，每隔12 h換新鮮無菌水，當(dāng)大部分豌豆芽長到1.5～2.0 cm時(shí)，選取萌芽整齊且胚根垂直的種子進(jìn)行栽培。栽培前，用相應(yīng)根瘤菌懸液浸泡發(fā)芽種子一段時(shí)間。

1.2.4 土壤篩選試驗(yàn) 將發(fā)芽的豌豆根部朝下，用無菌鑷子夾取，植入花盆中，每盆種植5顆，再在豌豆種子處接入根瘤菌菌液2 mL，并用塑料薄膜封閉盆口。每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，以不接菌作為空白對(duì)照。然后將豌豆移置于溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，待幼苗長出時(shí)，將塑料薄膜劃開小口。每隔一段時(shí)間澆無菌水1次。待豌豆長出第3張葉時(shí)定苗，每盆3株。生育期的管理結(jié)合土培試驗(yàn)的要求和豌豆植株生長的需要，在合理的時(shí)期搭好支架，防止豌豆倒伏。

1.2.5 收獲 待植株生長48 d后進(jìn)行收獲，同時(shí)進(jìn)行結(jié)瘤數(shù)、株高(從子葉痕處至離生長點(diǎn)最近的展開葉頂端)、地上部分干質(zhì)量(以第1張葉葉痕處為劃分標(biāo)準(zhǔn)，植物樣品先在烘箱中于105 ℃殺青2 h，然后于65 ℃烘干至恒質(zhì)量)、開花結(jié)莢情況的統(tǒng)計(jì)測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

通過統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，在滿足方差齊性的情況下，利用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，確定各因子水平內(nèi)部不同水平平均值之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種不同根瘤菌對(duì)豌豆生長性狀的影響

由表2可知，接種根瘤菌菌株對(duì)豌豆干質(zhì)量、結(jié)瘤數(shù)及株高影響均極顯著。由表3可知，接種不同的根瘤菌菌株均對(duì)豌豆干質(zhì)量有影響，在供試的18株菌中，豌豆干質(zhì)量增幅明顯的為Hbu610006、Hbu610015，相比空白對(duì)照分別增產(chǎn)82.35%、79.41%，差異達(dá)顯著水平；接種不同根瘤菌對(duì)豌豆結(jié)瘤數(shù)影響顯著，與對(duì)照相比，均有不同程度的增加，其中表現(xiàn)較好的有Hbu610005、Hbu610015等8株，分別比對(duì)照增加235.77%、231.20%等，與其他多數(shù)菌株具有顯著差異；對(duì)株高影響較大的為Hbu610018、Hbu610002，比空白對(duì)照分別增加 16.82%、15.64%，其次為Hbu610006、Hbu610003、Hbu610015、Hbu610007，分別比對(duì)照增加15.02%、14.12%、13.75%、13.47%。

2.2 接種不同根瘤菌菌株對(duì)豌豆開花、結(jié)莢的影響

由表4可知，接種不同的根瘤菌菌株對(duì)豌豆開花、結(jié)莢的影響不同。與對(duì)照相比，接種根瘤菌均在不同程度上增加了豌豆開花、結(jié)莢的數(shù)量，其中Hbu610006和Hbu6100015表現(xiàn)較好。Hbu610015的平均結(jié)莢數(shù)為1.1個(gè)/株，且42.86%的果莢莢長達(dá)到4.0 cm，其花苞數(shù)也達(dá)到0.8個(gè)/株。Hbu610006的果莢大小比較均一，豆莢長大多為2～3 cm，其平均花苞數(shù)達(dá)到 1.0個(gè)/株左右。而且，由表3可知，Hbu610006、Hbu610015的植株干質(zhì)量增幅明顯，Hbu610015的根瘤數(shù)比對(duì)照明顯增加，Hbu610006、Hbu610015的株高僅次于Hbu610018、Hbu610002(除Hbu610003略高于Hbu610015)?？梢?，植株的開花結(jié)莢數(shù)與干質(zhì)量、結(jié)瘤數(shù)等性狀表現(xiàn)一致，可作為篩選高效菌株的輔助參考指標(biāo)。

表2 不同根瘤菌菌株對(duì)豌豆生長性狀影響的方差分析

表3 接種不同根瘤菌菌株后地上部分干質(zhì)量、株高和結(jié)瘤數(shù)

注：根據(jù)Tukey檢驗(yàn)，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示不同處理間在0.05水平上差異顯著。

表4 接種不同根瘤菌后豌豆開花、結(jié)莢的數(shù)量

3 結(jié)論與討論

根瘤菌與豆科植物的共生具有宿主多樣性與專一性的特點(diǎn)。接種不同的根瘤菌后，與豌豆共生匹配性能較好的菌株，使豌豆在不同的生長性狀方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。本試驗(yàn)中，接種高效的根瘤菌Hbu610006和Hbu610015后，使豌豆干質(zhì)量、根瘤數(shù)等增加，結(jié)莢開花數(shù)增多，成熟期提前，最終表現(xiàn)出增產(chǎn)的效果，這與Liu等的研究結(jié)果[18]一致。在探究根瘤菌競(jìng)爭結(jié)瘤機(jī)制的研究中，肖文麗研究發(fā)現(xiàn)，與大豆共生固氮能力較強(qiáng)的菌株4534比共生能力較差的菌株4222產(chǎn)生更多的蛋白響應(yīng)，這些蛋白主要是代謝相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和鞭毛蛋白等[19]。

河北省滄州市屬于濱海鹽堿地區(qū)，可耕種土地極少，大部分為鹽堿耕地。據(jù)2006年統(tǒng)計(jì)[20]，黃驊輕度鹽堿耕地 2.46萬hm2，占耕地總面積的27.01%，中度鹽堿耕地 1.14萬hm2，占耕地總面積的12.55%，重度和極度鹽堿耕地 5 260 hm2，占耕地總面積的5.77%，其中絕大多數(shù)屬于中、低產(chǎn)田，若這些土地能被充分利用，將是增加糧食總產(chǎn)量的寶貴土壤資源[21-24]。將根瘤菌接種到花葉豌豆根部，可通過固氮作用為植物提供所需要的氮素。此外，根瘤菌通過分泌有機(jī)酸、氨基酸、酶等可增加植物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，促進(jìn)植物生長[25]；通過分泌植物激素、維生素、鐵載體等可提高植物的生物量[26]。在本試驗(yàn)中，為充分發(fā)揮高效根瘤菌的共生固氮在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益，選擇鹽堿土種植豌豆，通過豌豆與適宜根瘤菌的相互作用，豌豆植株可獲得生長所需的大部分氮素，長勢(shì)良好，并能增加土壤中根瘤菌及其他微生物的數(shù)量，明顯改善土壤營養(yǎng)狀況。在豌豆根瘤菌對(duì)酸堿和鹽分的適應(yīng)性研究中，謝軍紅等也指出，菌株的鹽堿忍耐能力因菌株而異[16]。在花葉豌豆結(jié)瘤試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)不同根瘤菌菌株對(duì)豌豆的干質(zhì)量、開花結(jié)莢情況影響不同。因此，將豌豆-根瘤菌的共生固氮作用與鹽堿土營養(yǎng)匱乏巧妙、有力地結(jié)合在一起，能夠充分利用前者的優(yōu)勢(shì)，改善鹽堿土的耕種情況，提高鹽堿土的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來可觀收益。

從供試菌株對(duì)豌豆生長性狀影響的綜合指標(biāo)來看，Hbu610006和Hbu610015的表現(xiàn)優(yōu)于其他菌株，與供試豌豆品種匹配性較好，可作為與花葉豌豆高效共生的菌株。

參考文獻(xiàn)：

[1]惠斯特勒 R J，貝密勒 J N，帕斯卡爾 E F. 淀粉的化學(xué)與工藝學(xué)[M]. 王錐文，閡大拴，楊家順，譯.北京：中國食品工業(yè)出版社，1987：21-24.

[2]楊曉明，任瑞玉. 國內(nèi)外豌豆生產(chǎn)和育種研究進(jìn)展[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2005(8)：3-5.

[3]龍靜宜. 食用豆類種植技術(shù)[M]. 北京：金盾出版社，2002.

[4]The United Nations Alliance of civilizations(UNAOC)[J]. International Understanding，2016(2)：60-61.

[5]宗緒曉，王志剛，關(guān)建平，等. 豌豆種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[6]金 虹. 豌豆蛋白質(zhì)提取工藝的優(yōu)化[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49(9)：2199-2201.

[7]Joseph S，Pow D，Dawson K，et al. Feeding biochar to cows：An innovative solution for improving soil fertility and farm productivity[J]. Pedosphere，2015，25(5)：666-679.

[8]馬 劍，黃高寶，高亞琴，等. 接種根瘤菌對(duì)豌豆根際細(xì)菌數(shù)量動(dòng)態(tài)變化及產(chǎn)量的影響[J]. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2009，27(6)：7-10.

[9]Arshad M，Shaharoona B，Mahmood T，et al. Inoculation withPseudomonasspp. containing ACC-deaminase partially eliminates the effects of drought stress on growth，yield，and ripening of pea (PisumsativumL.)[J]. Pedosphere，2008，35(5)：611-620.

[10]Yan H Q，Yu K F，Shi Q，et al. Coral reef ecosystems in the South China Sea as a source of atmospheric CO2in summer[J]. Science Bulletin，2011，56(7)：676-684.

[11]Chen J L，Liu J，Zhang Y L，et al. Establishment and application of both FLP and Cre site-specific recombination systems at the same position in the genome[J]. Science Bulletin，2000，45(5)：456-460.

[12]Palmer K M，Young J P. Higher diversity ofRhizobiumleguminosarumbiovar viciae populations in arable soils than in Grass soils[J]. Applied & Environmental Microbiology，2000，66(6)：2445.

[13]李友國，周俊初. 影響根瘤菌共生固氮效率的主要因素及遺傳改造[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2002，29(6)：86-89.

[14]中國科學(xué)院南京土壤研究所根瘤菌組.苕子根瘤菌優(yōu)良菌株的篩選[J]. 土壤，1974(5)：205-209.

[15]Deng J J，Zhang Y L，Hu J W，et al. Autotoxicity of phthalate esters in tobacco root exudates：effects on seed germination and seedling growth[J]. Pedosphere，2017，27(6)：1073-1082.

[16]謝軍紅，黃高寶，郭麗琢，等. 豌豆根瘤菌高效菌株的篩選及共生匹配性研究[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44(1)：102-106.

[17]張虎天，郭麗琢，柴 強(qiáng)，等. 接種根瘤菌對(duì)豌豆/玉米體系根際細(xì)菌數(shù)量及氮營養(yǎng)的影響[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46(1)：30-33，38.

[18]Liu L Z，Gong Z Q，Zhang Y L，et al. Growth，cadmium accumulation and physiology of marigold (TageteserectaL.) as affected by arbuscular mycorrhizal fungi[J]. Pedosphere，2011，21(3)：319-327.

[19]肖文麗. 大豆根瘤菌競(jìng)爭結(jié)瘤機(jī)理及其主要影響因子的初步研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010.

[20]岳耀杰，張 峰，張國明，等. 濱海鹽堿地利用變化與優(yōu)化研究——以黃驊市“臺(tái)田-淺池”模式為例[J]. 資源科學(xué)，2010，32(3)：423-430.

[21]王遵親，祝壽泉，俞仁培，等. 中國鹽漬土[M]. 北京：科學(xué)出版社，1993：400-515.

[22]石玉林. 中國1 ∶100萬土地資源圖土地資源數(shù)據(jù)集[M]. 北京：中國人民大學(xué)出版社，1991.

[23]全國土壤普查辦公室.中國土壤[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[24]李志杰，孫文彥，馬衛(wèi)萍，等. 鹽堿土改良技術(shù)回顧與展望[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(2)：73-77.

[25]Xie P，Hao X L，Herzberg M，et al. Genomic analyses of metal resistance genes in three plant growth promoting bacteria of legume plants in Northwest mine tailings，China[J]. Journal of Environmental Sciences，2015，27(1)：179-187.

[26]Zhao K F，Song J，F(xiàn)an H，et al. Growth response to ionic and osmotic stress of NaCl in salt-tolerant and salt-sensitive maize[J]. Journal of Integrative Plant Biology Crop Protection，2010，52(5)：468-475.