菌根真菌提高紫蘇根腐病抗性的機(jī)制研究

劉芳潔

(晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西晉中 030600)

紫蘇(PerillafrutescensL.)，別稱紅蘇、赤蘇，屬一年生唇形科紫蘇屬草本植物，在我國(guó)常作為蔬菜、藥用植物及油料作物進(jìn)行栽培，已有2 000多年的栽培歷史[1]。紫蘇根腐病是國(guó)內(nèi)外紫蘇栽培中常見的病害之一，致病菌為半知菌鏈孢霉真菌，以土壤為媒介進(jìn)行傳播，危害較為嚴(yán)重，嚴(yán)重影響紫蘇的產(chǎn)量和品質(zhì)，如何提高紫蘇根腐病抗性已成為紫蘇栽培中急需解決的關(guān)鍵問題[2]。菌根真菌是土壤中存在的一類可與植物根系形成有益共生體的微生物，主要有內(nèi)生菌根、外生菌根及內(nèi)外生菌根三大類型。眾多研究證實(shí)，菌根真菌可以改善植物根系的生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物抵御不良環(huán)境的能力，尤其在提高植物抗病性方面作用顯著[3-5]。韓亞楠等研究表明，接種AM真菌可顯著提高連作西瓜的植株生物量，并對(duì)西瓜枯萎病的發(fā)生具有一定的防治效果[6]；張淑彬等研究表明，接種叢枝菌根真菌可有效防止辣椒苗期疫霉病的發(fā)生，且不同菌種防治效果存在很大差異[7]；秦海濱等研究表明，接種叢枝菌根真菌可顯著提升黃瓜幼苗的生物量及保護(hù)酶活性，顯著提高立枯病抗性，降低發(fā)病率[8]；張茹琴等研究表明，4種外生菌根真菌均可與油松幼苗形成菌根，灰鵝膏菌對(duì)油松猝倒病防治效果最好[9]；趙菊蓮等研究認(rèn)為，接種菌根真菌可顯著提升草莓的保護(hù)酶活性，提高對(duì)枯萎病的抗性[10]；劉東岳等研究表明，叢枝菌根真菌和植物根圍促生細(xì)菌同時(shí)接種可顯著提升黃瓜枯萎病抗性，且不同菌劑組合防治效果差異顯著[11]；湛蔚等研究表明，接種叢枝菌根真菌可明顯提升楊樹根系的超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、幾丁質(zhì)酶(CHT)及β-1，3-葡聚糖酶(GLU)活性，楊樹潰瘍病抗性效果顯著優(yōu)于接種外生菌根真菌[12]。菌根真菌的生物學(xué)效應(yīng)常因寄主植物而異[13]，而目前尚未見關(guān)于菌根真菌對(duì)紫蘇根腐病抗性的影響研究報(bào)道。因此，本研究以奇蘇1號(hào)紫蘇為試驗(yàn)材料，分析不同菌根真菌對(duì)紫蘇根腐病抗性的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究，以期為紫蘇根腐病的生物防治提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試紫蘇品種為奇蘇1號(hào)，由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油菜研究所提供。供試叢枝菌根真菌為摩西球囊霉(Glomusmosseae)，外生菌根真菌為褐黃牛肝菌(Boletusluridus)，均由北京市農(nóng)林科學(xué)院菌根真菌種質(zhì)庫(kù)提供；紫蘇根腐病病原菌半知菌鏈孢霉真菌由筆者所在實(shí)驗(yàn)室自主分離保存；供試基質(zhì)為草炭蛭石(1 ∶1)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2016年8月15日開始實(shí)施，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的奇蘇1號(hào)幼苗180株，分別定植于30 cm×40 cm 的花盆中，每盆1株，栽培基質(zhì)為滅菌的草炭蛭石。試驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)處理，即分別于定植前接種15 g叢枝菌根真菌(AMF)、接種15 g外生菌根真菌(ECMF)及接種滅菌的15 g菌根真菌(CK)，每處理20盆，重復(fù)3次，共計(jì)180株，試驗(yàn)期間給予各處理正常的水肥管理。定植90 d后，測(cè)定各處理的菌根侵染率。侵染成功后，接種半知菌鏈孢霉真菌，隨水澆于根際4周，接種量為2.0×106CFU/g土。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)及方法 菌根侵染率采用Phillips等的方法[14]進(jìn)行測(cè)定，菌根侵染率=侵染菌根段數(shù)/檢測(cè)菌根段數(shù)×100%；病情指數(shù)調(diào)查方法：自接種半知菌鏈孢霉真菌起，各處理每隔5 d調(diào)查1次，病情指數(shù)及防病效果按趙仕光等的方法[15]進(jìn)行計(jì)算；自接種半知菌鏈孢霉真菌起，各處理每隔5 d進(jìn)行一次生理生化指標(biāo)測(cè)定，測(cè)定樣品為紫蘇根系。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用抑制NBT光還原比色法測(cè)定；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定；苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性采用苯丙氨酸比色法進(jìn)行測(cè)定；丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法；脯氨酸(Pro)含量測(cè)定采用磺基水楊酸提取法；幾丁質(zhì)酶(CTH)及β-1，3-葡聚糖酶(GLU)活性參照Fink等的方法[16]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及作圖，用SPSS 18.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根真菌對(duì)紫蘇根腐病病情指數(shù)及防病效果的影響

菌根真菌接種90 d后，接種AMF和ECMF的菌根侵染率分別達(dá)到82.36%和73.25%，對(duì)照無菌根產(chǎn)生。這說明，AMF和ECMF均可與紫蘇形成良好的互利共生關(guān)系，且紫蘇幼苗期AMF侵染率較高。菌根真菌對(duì)紫蘇根腐病病情指數(shù)及防病效果的影響如圖1所示，在整個(gè)試驗(yàn)期間，3種處理的根腐病病情指數(shù)均隨著紫蘇的生長(zhǎng)逐漸升高，其中，接種AMF真菌的病情指數(shù)始終保持最低，其余依次為接種ECMF的和CK(圖1-a)；接種半知菌鏈孢霉真菌30 d時(shí)，CK、AMF和ECMF的病情指數(shù)分別達(dá)到61.82、39.02和47.28，假定CK防效為0，接種AMF和ECMF的防效分別達(dá)到76.82%和 57.25%(圖1-b)。這說明，接種菌根真菌可顯著提升紫蘇的根腐病防治效果，且接種AMF效果顯著優(yōu)于ECMF。

2.2 菌根真菌對(duì)紫蘇根系保護(hù)酶活性的影響

由表1可知，接種半知菌鏈孢霉真菌后，3種處理?xiàng)l件下的紫蘇根系超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)及苯丙氨酸解氨酶(PAL)4種保護(hù)酶活性均隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且接種AMF的保護(hù)酶活性始終保持最高，依次為接種ECMF和對(duì)照(CK)。接種半知菌鏈孢霉真菌10 d時(shí)，對(duì)照(CK)的SOD、POD、CAT及PAL活性均達(dá)到最高，分別為32.28、261.58、272.53、2.02 U/(g·min)；接種AMF和ECMF的紫蘇根系SOD、POD及CAT酶活性均在接種半知菌鏈孢霉真菌20 d時(shí)達(dá)到最大，其中接種AMF的紫蘇根系SOD、POD及CAT酶活性分別為 43.05、372.83、342.36 U/(g·min)，較同期CK分別提升 49.95%、68%和222.67%，均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)；接種ECMF的紫蘇根系SOD、POD及CAT酶活性分別為40.14、352.26、325.81 U/(g·min)，較同期CK分別提升39.81%、58.73%和111.91%，均達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)；接種AMF和ECMF的紫蘇根系PAL酶活性均在接種半知菌鏈孢霉真菌15 d時(shí)達(dá)到最大，分別為2.42、 2.32 U/(g·min)，較同期CK分別提升81.95%和74.44%，分別達(dá)到極顯著(P<0.01)和顯著差異水平(P<0.05)。這說明，接種菌根真菌可顯著提升半知菌鏈孢霉真菌侵染的紫蘇根系的保護(hù)酶活性，且接種AMF的提升效果顯著高于接種ECMF(P<0.05)。

2.3 菌根真菌對(duì)紫蘇根系丙二醛及游離脯氨酸含量的影響

菌根真菌對(duì)紫蘇根系丙二醛(MDA)含量的影響如圖2-a所示，接種半知菌鏈孢霉真菌后，3種處理?xiàng)l件下的紫蘇根系MDA含量均隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，且接種AMF的紫蘇根系MDA含量始終保持最低，其余依次為接種ECMF的和對(duì)照(CK)。接種半知菌鏈孢霉真菌5 d時(shí)，CK的根系MDA含量達(dá)到最低，為15.47 nmol/g，而接種AMF和ECMF的紫蘇根系MDA含量均在接種半知菌鏈孢霉真菌 10 d 時(shí)達(dá)到最低，分別為14.02、15.18 nmol/g。接種半知菌鏈孢霉真菌30 d時(shí)，CK、接種AMF和ECMF等3種處理的紫蘇根系MDA含量均達(dá)到最大，分別為47.88、34.22、40.02 nmol/g，接種AMF和ECMF的分別較CK降低28.53%和16.42%，分別達(dá)到極顯著(P<0.01)和顯著差異水平(P<0.05)。這說明，根腐病病原菌侵染初期的紫蘇根系MDA含量略有下降，隨后逐漸升高，而接種菌根真菌的紫蘇根系MDA含量則顯著低于同期CK，且接種AMF效果顯著優(yōu)于接種ECMF(P<0.05)。

由圖2-b可知，接種半知菌鏈孢霉真菌后，3種處理?xiàng)l件下的紫蘇根系游離脯氨酸(Pro)含量均隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，且接種AMF的紫蘇根系Pro含量始終保持最高，其余依次為接種ECMF的和對(duì)照(CK)。接種半知菌鏈孢霉真菌30 d時(shí)，CK、接種AMF和ECMF這3種處理的紫蘇根系Pro含量均達(dá)到最大，分別為39.03、53.28、46.81 μg/g，接種AMF和ECMF的分別較CK高36.51%和19.93%，與對(duì)照相比分別達(dá)到極顯著(P<0.01)和顯著差異水平(P<0.05)。這說明，接種菌根真菌可顯著提升半知菌鏈孢霉真菌侵染的紫蘇根系的游離脯氨酸(Pro)含量， 且接種AMF效果顯著優(yōu)于接種ECMF(P<0.05)。

表1 菌根真菌對(duì)紫蘇根系保護(hù)酶活性的影響

注：不同小寫字母表示同項(xiàng)指標(biāo)不同處理差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同項(xiàng)指標(biāo)同一處理不同時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)。

2.4 菌根真菌對(duì)紫蘇根系幾丁質(zhì)酶(CHT)和β-1，3-葡聚糖酶(GLU)活性的影響

菌根真菌對(duì)紫蘇根系幾丁質(zhì)酶(CHT)活性的影響如圖 3-a所示，接種半知菌鏈孢霉真菌后，對(duì)照(CK)和接種ECMF的紫蘇根系CHT活性隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，而接種AMF的紫蘇根系CHT活性則呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，且接種AMF的CHT活性始終保持最高，其余依次為接種ECMF的和CK。在接種半知菌鏈孢霉真菌15 d時(shí)，CK處理的CHT活性達(dá)到最大，為23.26 U/mg，而接種AMF和ECMF處理的CHT活性則分別在接種半知菌鏈孢霉真菌 20 d 和30 d時(shí)達(dá)到最大，分別為38.22、28.26 U/mg，較同期CK分別提升345.97%和55.62%，分別達(dá)到極顯著(P<0.01)和顯著差異水平(P<0.05)。這說明，接種菌根真菌可顯著提升半知菌鏈孢霉真菌侵染的紫蘇根系的幾丁質(zhì)酶活性，且接種AMF的提升效果顯著高于接種ECMF的(P<0.05)。

由3-b可知，接種半知菌鏈孢霉真菌后，對(duì)照(CK)的紫蘇根系β-1，3-葡聚糖酶(GLU)活性隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，而接種AMF和ECMF的紫蘇根系GLU活性則呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，且接種AMF的GLU活性始終保持最高，其余依次為接種ECMF的和CK。接種半知菌鏈孢霉真菌15 d時(shí)，CK的紫蘇根系GLU活性達(dá)到最大，為 45.24 U/mg。接種AMF和ECMF的紫蘇根系GLU活性在接種半知菌鏈孢霉真菌30 d時(shí)達(dá)到最大，分別為183.72、143.86 U/mg，分別較同期CK提升431.29%和316.02%，分別達(dá)到極顯著(P<0.01)和顯著差異水平(P<0.05)。這說明，接種菌根真菌可顯著提升半知菌鏈孢霉真菌侵染的紫蘇根系的β-1，3-葡聚糖酶活性，且接種AMF的提升效果顯著高于接種ECMF(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

菌根真菌可與植物根系形成互利共生體，參與植物的多種代謝過程，生物學(xué)效應(yīng)廣泛[17-17]，尤其在誘導(dǎo)植物提高抗病性方面作用顯著，減輕病害發(fā)生程度[3-5]。本研究結(jié)果表明，AMF和ECMF均可與紫蘇形成菌根，侵染率分別達(dá)到82.36%和73.25%，對(duì)紫蘇根腐病的防效分別達(dá)到76.82%和57.25%。

植物在遭遇生物和非生物脅迫時(shí)，其體內(nèi)的抗性防御系統(tǒng)會(huì)被啟動(dòng)，以最大程度減少逆境對(duì)自身的傷害。大量研究表明，形成菌根的植株可以對(duì)病原菌的入侵產(chǎn)生快速的防御反應(yīng)，可以明顯提高植物的保護(hù)酶活性，進(jìn)而有效清除因病原菌入侵而形成的氧化逆境，防止對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生更嚴(yán)重的氧化損失，提升植物對(duì)病原菌的抗性[19-21]。本研究結(jié)果表明，接種菌根真菌可顯著提升半知菌鏈孢霉真菌侵染的紫蘇根系的SOD、POD、CAT及PAL活性，且接種AMF的提升效果顯著高于接種ECMF，其原因可能是由于AMF與紫蘇的親和度高于ECMF所致；MDA是反映細(xì)胞膜膜脂過氧化程度的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明， 接種菌根真菌可顯著降低半知菌鏈孢霉真菌侵染的紫蘇根系的MDA，且接種AMF的降低效果顯著優(yōu)于接種ECMF，這說明接種AMF的紫蘇細(xì)胞膜受損害程度最輕，其原因可能是接種AMF的紫蘇根系保護(hù)酶活性顯著高于接種ECMF和對(duì)照所致；游離脯氨酸含量是反映植物響應(yīng)逆境強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，接種菌根真菌可顯著提升半知菌鏈孢霉真菌侵染的紫蘇根系的游離脯氨酸含量，且接種AMF效果顯著優(yōu)于接種ECMF，這說明接種AMF的紫蘇響應(yīng)半知菌鏈孢霉真菌侵染的能力較強(qiáng)。

幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶通過破壞真菌細(xì)胞壁而抑制病原菌的生長(zhǎng)，是植物對(duì)病原菌入侵的一種重要的防衛(wèi)反應(yīng)[22]。湛蔚等研究表明，接種AMF可明顯提高潰瘍病病菌侵染楊樹幼苗的幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性，而接種ECMF則提升效果不明顯[12]。本研究結(jié)果表明，接種菌根真菌可顯著提升半知菌鏈孢霉真菌侵染的紫蘇根系的幾丁質(zhì)酶及β-1，3-葡聚糖酶活性，且接種AMF的提升效果顯著高于接種ECMF，這說明接種AMF的紫蘇防衛(wèi)反應(yīng)顯著優(yōu)于接種ECMF，本研究結(jié)果與湛蔚等的研究結(jié)果[12]存在一定出入，其原因尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，接種AMF可顯著提升紫蘇根腐病的防治效果，其原因是接種AMF可顯著提升紫蘇根系的保護(hù)酶活性，緩解病原菌入侵對(duì)植物細(xì)胞膜造成的傷害，提升了植物對(duì)病原菌入侵的響應(yīng)能力，幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性顯著提升，顯著抑制了病原菌的生長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]馬 堯，孫玉開. 不同品種紫蘇形態(tài)、生理指標(biāo)初步研究[J]. 種子，2009，28(6)：51-53.

[2]何永梅. 紫蘇主要病蟲害防治要點(diǎn)[J]. 北京農(nóng)業(yè)，2012，12(6)：16-17.

[3]袁麗環(huán)，閆桂琴. 叢枝菌根化翅果油樹幼苗根際土壤微環(huán)境[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，34(6)：678-686.

[4]王林闖，賀超興，張志斌. AM真菌對(duì)不同栽培基質(zhì)甜椒生長(zhǎng)及產(chǎn)量品質(zhì)的影響[J]. 中國(guó)蔬菜，2010(16)：32-37.

[5]劉潤(rùn)進(jìn)，唐 明，陳應(yīng)龍. 菌根真菌與植物抗逆性研究進(jìn)展[J]. 菌物研究，2017，15(1)：70-88.

[6]韓亞楠，畢美光，劉潤(rùn)進(jìn)，等. AM真菌對(duì)連作西瓜生長(zhǎng)及其枯萎病的影響[J]. 北方園藝，2013(13)：150-153.

[7]張淑彬，劉建斌，王幼珊. 叢枝菌根真菌對(duì)辣椒疫霉病害防治的初步研究[J]. 北方園藝，2015(5)：125-128.

[8]秦海濱，張志斌，賀超興. 叢枝菌根真菌提高黃瓜幼苗抗立枯病作用研究[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2014，29(增刊1)：98-102.

[9]張茹琴，唐 明，張海涵. 四種外生菌根真菌對(duì)油松幼苗的抗猝倒病和促生作用[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2011，30(5)：812-816.

[10]趙菊蓮. 叢枝菌根真菌誘導(dǎo)草莓枯萎病抗性機(jī)理研究[J]. 北方園藝，2013(17)：115-117.

[11]劉東岳，李 敏，孫文獻(xiàn)，等. 抗黃瓜枯萎病叢枝菌根真菌與根圍促生細(xì)菌組合菌劑的篩選[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2016，46(6)：821-832.

[12]湛 蔚，劉洪光，唐 明. 菌根真菌提高楊樹抗?jié)儾∩砩瘷C(jī)制的研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2010，30(12)：2437-2443.

[13]杜俊卿. 接種叢枝菌根真菌對(duì)不同綠化植物根際微環(huán)境的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(18)：149-152.

[14]Phillips J M，Hayman D S. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection[J].Transactions of the British Mycological Society， 1970，55:158-160.

[15]趙仕光，景 耀，楊俊秀. 楊樹樹皮內(nèi)過氧化物酶和多酚氧化酶活性與抗?jié)儾〉年P(guān)系[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)， 1993，8(3):13-17.

[16]Fink W，Liefland M，Mendgen K. Chitinases and beta-1，3-glucanases in the apoplastic compartment of oat leaves(AvenasativaL.)[J].Plant Physiology，1988，88(2):273-275.

[17]李少朋，畢銀麗，彭星.接種叢枝菌根真菌對(duì)礦井水回灌玉米生長(zhǎng)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(5)：112-115.

[18]王麗麗，楊 謙. 接種枯草芽孢桿菌和叢枝菌根真菌促進(jìn)紅三葉修復(fù)石油污染土壤[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(5)：526-529.

[19]李 敏，王維華，劉潤(rùn)進(jìn). AM真菌和鐮刀菌對(duì)西瓜根系膜脂過氧化作用和膜透性的影響[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2003，33(3)：229-232.

[20]Kapoor R.Induced resistance in mycorrhizal tomato is correlated to concentration of jasmonic acid[J]. Journal of Biological Sciences，2008，8(3)：49-56.

[21]高雁琳，李鈞敏，閆 明.接種AMF對(duì)煤礦廢棄物上高丹草根系生長(zhǎng)及抗氧化酶系統(tǒng)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(12)：452-456.

[22]左豫虎，康振生，楊傳平，等.β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性與大豆對(duì)疫霉根腐病抗性的關(guān)系[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2009，39(6)：600-607.