高效液相色譜法檢測蜂蜜中的氯霉素

肖婉娜，何 敏，陳怡佳

（廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510430）

氯霉素屬抑菌性廣譜抗生素，對(duì)人體的造血系統(tǒng)有很大的毒副作用[1]。目前很多企業(yè)對(duì)該藥物殘留的檢測采用快速檢測法，難以定量。因此，試驗(yàn)采用液相色譜法檢測蜂蜜中的氯霉素，并與快速檢測法進(jìn)行對(duì)比。

1 試驗(yàn)材料

1.1 材料

甲醇、乙腈（HPLC級(jí)）；氯霉素、乙酸乙酯、氫氧化鈉、磷酸氫二銨等，均為分析純；蜂蜜；快檢試劑盒。

1.2 儀器

島津LC-15C型、DL-360B型超聲波清洗器，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，TG16-WS型離心機(jī)等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 液相色譜檢測方法探究

2.1.1 樣品前處理方法的選擇

（1）方法1（化學(xué)法[2]）。稱10 g蜂蜜加入5 mL水混勻，再加20 mL乙酸乙酯超聲處理30 s，然后加入NaCl和NaOH超聲處理2 min后離心，移出提取液。再向殘?jiān)屑尤胍宜嵋阴ブ貜?fù)上述提取步驟，合并提取液，減壓旋干，用乙腈溶解，加MgSO4離心，上清液待測。

（2）方法2（固相萃取法[3]）。稱10 g蜂蜜加水5 mL，再加入20 mL乙酸乙酯，振蕩后離心，吸取乙酸乙酯減壓蒸干，加入5 mL水溶解殘?jiān)谷牖罨玫墓滔噍腿≈芟?，再用乙酸乙酯洗脫，洗脫液吹干，用乙腈溶解待測。

2.1.2 流動(dòng)相和柱溫的選擇

C18色譜柱、紫外278 nm，采用不同流動(dòng)相（a.40%甲醇-0.2%磷酸氫二銨；b.30%乙腈-水；c.30%甲醇-水）和不同柱溫（室溫，30，40，50，60℃）進(jìn)行采集。

2.1.3 陰性對(duì)照

取流動(dòng)相進(jìn)樣，再取不同濃度氯霉素溶液做峰增高法定性。

2.2 方法驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系

配制1 mg/mL氯霉素甲醇儲(chǔ)備液，再稀釋成0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。

2.2.2 回收率和精密度

稱蜂蜜4份，分別加入不同質(zhì)量濃度的氯霉素對(duì)照品溶液，使蜂蜜中氯霉素的質(zhì)量濃度為0.1，8.0，40 μg/kg，平行測定3次，計(jì)算回收率。再稱取蜂蜜6份，按相同方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣，計(jì)算RSD值。

2.2.3 檢出限和定量限

取標(biāo)液不斷稀釋，當(dāng)信噪比為3時(shí)作為方法的檢出限，信噪比為10時(shí)為方法的定量限[4]。

2.3 高效液相色譜法與快速檢測法的比較

稱取7份含有氯霉素蜂蜜用空白蜂蜜稀釋成不同質(zhì)量濃度，記為樣①～⑦號(hào)，同時(shí)做快速檢測和液相檢測；再將對(duì)照液稀釋成0.100，0.05，0.04，0.03，0.02，0.01 ng/mL進(jìn)行快檢，將對(duì)照品的顯色結(jié)果作為樣品的參照，推出蜂蜜中氯霉素的實(shí)際質(zhì)量濃度，得到快速檢測法的檢出限，與液相色譜法的檢出限進(jìn)行對(duì)比。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法選擇

3.1.1 不同凈化方法的對(duì)比

不同方法制備的供試品溶液的液相譜圖比較見圖1。

圖1 不同方法制備的供試品溶液的液相譜圖比較

圖3 不同氯霉素濃度蜂蜜試液的色譜圖

從圖1可以看出，化學(xué)法除雜效果較差，雖氯霉素檢出含量高，但可能是在保留時(shí)間處有其他雜質(zhì)與目標(biāo)物重疊。

3.1.2 流動(dòng)相和柱溫的選擇

不同流動(dòng)相洗脫的液相結(jié)果見表1。

表1 不同流動(dòng)相洗脫的液相結(jié)果

流動(dòng)相c氯霉素出峰最晚，流動(dòng)相b出峰最快；理論塔板數(shù)c＞b＞a＞4 000，符合藥典要求，且氯霉素都能完全分離，峰形也較好。流動(dòng)相a含有緩沖鹽，配制和沖洗過程較繁瑣；流動(dòng)相c的洗脫能力比b弱，在沖洗時(shí)會(huì)消耗較多試劑，因此，流動(dòng)相b最合適。

不同柱溫下液相結(jié)果見表2。

表2 不同柱溫下液相結(jié)果

當(dāng)流動(dòng)相和色譜柱之間的溫差增大時(shí)，由于溫度不平衡會(huì)導(dǎo)致的峰變形加劇[5]，從表2可以看出，柱溫20～60℃時(shí)，隨柱溫升高，保留時(shí)間變短，同時(shí)分離度、峰寬也發(fā)生變化，升高柱溫會(huì)使塔板數(shù)降低，峰形變差。綜合考慮，選40℃作為檢測柱溫。

3.1.3 陰性對(duì)照

流動(dòng)相的液相色譜見圖2，不同氯霉素質(zhì)量濃度蜂蜜試液的色譜見圖3。

圖2 流動(dòng)相的液相色譜圖

從圖2～圖3可以看出，標(biāo)液中2.537 min的峰是溶劑峰，6.410 min的為氯霉素峰，2.011 min的峰為雜峰。

3.2 方法驗(yàn)證

3.2.1 線性關(guān)系考查

氯霉素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖4 氯霉素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖4的公式和相關(guān)系數(shù)看出，對(duì)照品溶液在0.10～10.00 μg/mL的范圍內(nèi)線性良好。

3.2.2 回收率和精密度

加標(biāo)回收率平均為81.68%，RSD值為10.81%，該方法準(zhǔn)確度和精密度較好。

3.2.3 檢出限和定量限

氯霉素標(biāo)液稀釋至S/N=3.56時(shí)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL，在蜂蜜中的檢出限為0.625 μg/kg。S/N=10.81時(shí)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為10 ng/mL，則方法的定量限為 8 μg/kg。

3.3 液相色譜法與快速檢測法的比較

不同質(zhì)量濃度氯霉素的樣品快檢結(jié)果對(duì)比見表3，不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液快檢結(jié)果見表4。

表3 不同質(zhì)量濃度氯霉素的樣品快檢結(jié)果對(duì)比

+++++++++++++++++++++++++++注：“+”表示顏色的深度，“+”越多則顏色越深檢測項(xiàng)目空白樣⑦樣⑥樣⑤樣④樣③樣②樣①C T++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

表4 不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液快檢結(jié)果

根據(jù)說明書，測試線T比對(duì)照線C深或相同，則氯霉素質(zhì)量濃度低于檢出限或不含氯霉素。若T比C淺表示氯霉素質(zhì)量濃度高于檢出限，越淺則質(zhì)量濃度越高。因此看表3和4中樣①和標(biāo)0.01 ng/mL快檢陽性，經(jīng)換算此時(shí)蜂蜜中氯霉素含量0.125 μg/kg。隨著樣品與標(biāo)中氯霉素質(zhì)量濃度降低，T漸深，到樣⑤和標(biāo)0.04 ng/mL T仍比C淺，說明氯霉素仍能檢出，到樣⑥和標(biāo)0.05 ng/mL時(shí)，T與C完全一致，氯霉素已檢不出。因此樣⑤和標(biāo)0.04 ng/mL是氯霉素檢出限，經(jīng)換算得快檢法氯霉素檢出限為 0.062 5 μg/kg。在 0.125～0.062 5 μg/kg 時(shí)，快檢顏色變化成一定梯度，可做作為半定量的依據(jù)。

蜂蜜樣與氯霉素對(duì)照品的色譜見圖6。

圖6 蜂蜜樣與氯霉素對(duì)照品的色譜

將快檢陽性的樣①、②的液相譜圖與標(biāo)0.5 ng/mL（儀器檢出限）的液相譜圖進(jìn)行對(duì)比，樣品在標(biāo)的保留時(shí)間6.405 min處沒有出峰，可見快檢法靈敏度更高。但在6.7 min有一疑似峰，與目標(biāo)峰部分重疊，需要用質(zhì)譜進(jìn)一步確認(rèn)。

4 結(jié)論

用固相萃取柱凈化，40℃柱溫，30%乙腈作為流動(dòng)相，該方法回收率81.68%，精密度10.81%，檢出限為0.625 μg/kg，相比快速檢測條差10倍，雖無法達(dá)到國標(biāo)方法的最低檢出限0.1 μg/kg，但是在檢出限質(zhì)量濃度時(shí)氯霉素保留時(shí)間附近有一疑似峰，不能排除此方法能檢出更低質(zhì)量濃度的可能性。

[1]姚駿，李沛然，暴悅梅，等.動(dòng)物源性食品中氯霉素殘留檢測研究進(jìn)展 [J].食品研究與開發(fā)，2014（4）：118-120.

[2]吳華，黃鴻，歐劍峰，等.高效液相色譜法測定蜂蜜中氯霉素殘留量的研究 [J].四川化工，2009，12（3）：40-42.

[3]盧坤，童群義.高效液相色譜法同時(shí)檢測蜂蜜中的5類抗生素殘留 [J].分析測試學(xué)報(bào)，2011，30（11）：1 320-1 323，1 328.

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