復(fù)合酶法制備化妝品用薏米提取液工藝研究

林瑞敏

（福建省輕工業(yè)研究所，福建 福州 350005）

薏米屬禾本科蜀黍族薏苡屬，又名薏苡仁、苡仁、薏仁米，是我國衛(wèi)生部公開的藥食兼用食品[1-2]。薏米在我國大部分地區(qū)均有種植，主要產(chǎn)于福建、河北、陜西、湖南、江蘇等地。薏米的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值在禾本植物中獨(dú)占鰲頭，因此，被譽(yù)為“世界禾本植物之王”[3]。據(jù)《中國食療大典》記載：薏米含蛋白質(zhì)14%、脂肪5%、碳水化合物65%、鈣0．07%、磷0．242%、鐵0．001% 。薏米中已發(fā)現(xiàn)的活性成分主要有薏苡多糖、薏苡酯、薏苡素、木脂素類、酚類、多種不飽和脂肪酸、苯并嗪酮、氧氮雜萘酮、三萜類開環(huán)化合物及多種氨基酸等[4]。

生物活性多糖具有許多護(hù)膚性能，包括延緩衰老、血管美容、抗粉刺、修復(fù)皮膚組織、美白和保濕作用，多糖的生物學(xué)活性和理化性質(zhì)為其在化妝品中的應(yīng)用提供了依據(jù),將各種多糖應(yīng)用于化妝品中，能產(chǎn)生保濕、穩(wěn)定、改善膚色、抗衰老和抗菌等功能，且高分子多糖無毒副作用，與常用化妝品成分配伍性好[5]。

薏米是重要的中藥材和化妝品添加劑。在日本，薏米一致被視為珍貴的滋補(bǔ)、保健、沐浴和潤膚佳品[6]?，F(xiàn)代研究表明：薏苡仁多糖主要含薏米多糖A、B、C，中興葡聚糖1～7，酸性多糖CA-1和CA-2等多種多糖組分[7]；薏米提取物可延緩皮膚衰老，具有防皺、防裂等作用，對(duì)于醫(yī)治面部粉刺、痤瘡、改善皮膚粗糙均有一定效果；同時(shí)，薏米提取物對(duì)紫外線有較強(qiáng)的吸收能力，對(duì)皮膚有防曬作用。薏米提取物已廣泛應(yīng)用于粉刺霜、痤瘡膏、雪花膏、香波、頭發(fā)營養(yǎng)劑、防曬化妝水、消炎性乳液及治療皮膚病的產(chǎn)品生產(chǎn)中。

目前，對(duì)薏米的研究多集中在食品工業(yè)用和藥理作用方面，對(duì)開發(fā)應(yīng)用于化妝品的薏米提取液的工藝研究報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)以薏米為原料，采用復(fù)合酶酶解薏米，通過單因素及正交試驗(yàn)確定酶解薏米的最佳工藝及參數(shù)，為薏米的精深加工和提高經(jīng)濟(jì)附加值提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1．1．1 材料

薏米：福建省仙游縣金沙食品有限公司；

中溫α-淀粉酶（7000 U/g）、糖化酶（100000 U/g）：江蘇博立生物制品有限公司；

碘液、濃硫酸、無水乙醇、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、苯酚等均為分析純，市售。1．1．2 儀器設(shè)備

F-W-200高速萬能粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；

歐洲之星100數(shù)顯型攪拌器（江蘇省科學(xué)器材有限公司）；

FY-1C旋片式真空抽濾泵（溫嶺市飛越機(jī)電有限公司）；

723PC型可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；PHS-3C型酸度計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；

糖度計(jì)（泉州光學(xué)儀器有限公司）；

101-1型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(上海雙彪儀器設(shè)備有限公司)；

FA2004電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；玻璃儀器等。

1.2 方法

1．2．1 提取工藝流程

1．2．2 操作要點(diǎn)

1．2．2．1 粉碎：選用優(yōu)質(zhì)薏米，要求籽粒飽滿、色澤光潔，無霉變、蛀蟲，將薏米用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，制成薏米粉備用。

1．2．2．2 調(diào)漿：稱取薏米粉，按料液比加入水浸泡，浸泡1～3 h，使薏米充分吸水后攪拌混合均勻。

1．2．2．3 糊化：將浸泡液加熱至85 ℃，保溫糊化30 min，糊化時(shí)為了防止底部粘度過高產(chǎn)生結(jié)塊燒焦，應(yīng)邊糊化邊進(jìn)行攪拌。

1．2．2．4 液化：將薏米糊化液冷卻至淀粉酶適宜溫度(70±2)℃，加入中溫α-淀粉酶25 U/g進(jìn)行液化，通過碘液檢測(cè)判定液化終點(diǎn)，確定液化時(shí)間。

1．2．2．5 糖化：酶解液降溫至糖化酶適宜溫度(58±2)℃，調(diào)節(jié)pH為糖化酶適宜的pH(5．0±0．2)，加入糖化酶酶解，根據(jù)提取液中粗多糖含量判定糖化終點(diǎn)。1．2．2．6 滅酶：將糖化后的溶液加熱至95 ℃，保溫10 min滅酶。

1．2．2．7 篩濾：滅酶后，過100目篩，去除薏米渣，得提取液備用。

1．2．2．8 澄清：提取液加入澄清劑，攪拌均勻，靜置澄清8～12 h。

1．2．2．9 過濾：吸取上清液，采用硅藻土過濾。

1．2．2．10 灌裝、封口、殺菌：將澄清過濾液加熱至90 ℃后趁熱灌裝封口，采用85 ℃、40 min進(jìn)行殺菌，然后冷卻至室溫。

1．2．3 檢測(cè)方法

1．2．3．1 液化終點(diǎn)的確定方法

取液化溶液1滴至瓷點(diǎn)滴板，加1滴碘溶液，觀察反應(yīng)顏色。若顯藍(lán)色，說明溶液中還有淀粉；若反應(yīng)不顯藍(lán)色呈棕黃色，則說明溶液中不含淀粉，達(dá)液化終點(diǎn)。

1．2．3．2 粗多糖檢測(cè)方法

采用苯酚-硫酸法[9]

（1）樣品測(cè)定液制備：吸取薏米提取液試樣15．0 mL，加入20 mL無水乙醇，同時(shí)使用渦旋振蕩器，使混合均勻，于4000 r/min離心10 min，棄去上清液；不容物用10 mL乙醇溶液（80%）洗滌3次；殘?jiān)盟芙獠⑥D(zhuǎn)至容量瓶中，加水定容至100 mL。此溶液為樣品測(cè)定液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別吸取0、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0 mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作溶液（100 mg/L）置20 mL具塞玻璃試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1．0 mL向試液中加入1．0 mL苯酚溶液（5%），然后迅速加入5．0 mL硫酸，靜置10 min；使用渦旋振蕩器使反應(yīng)液充分混合，然后將試管置于30 ℃水浴反應(yīng)中反應(yīng)20 min，490 nm處測(cè)吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=9．9286x+0．0126，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線

（3）多糖含量測(cè)定：吸取1．0 mL樣品測(cè)定液，置于20 mL具塞試管中，按（2）步驟操作，測(cè)定吸光度，同時(shí)做空白試驗(yàn)。若測(cè)得的吸光度超出所得的葡萄糖回歸曲線的范圍，則應(yīng)相應(yīng)的減少或增加吸取試劑量，保證讀數(shù)在回歸曲線范圍內(nèi)。做平行試驗(yàn)3次，取平均值，然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出被測(cè)液中葡萄糖的濃度，再換算成一定質(zhì)量薏米多糖得率。多糖得率=（提取多糖的質(zhì)量/薏米樣品質(zhì)量）×100%

1．2．4 實(shí)驗(yàn)方法

因各種酶制劑具有其最適作用pH、溫度，液化酶的用量取決于底物中淀粉的含量，因此本研究中液化酶添加量、液化溫度、液化pH及糖化溫度、糖化pH根據(jù)原料說明書提供的適宜條件執(zhí)行。影響薏米粗多糖得率的主要因素為：料液比、液化時(shí)間、糖化酶添加量和糖化時(shí)間。

1．2．4．1 不同料液比對(duì)多糖得率的影響

采用不同料液比進(jìn)行調(diào)漿，85 ℃糊化30 min后冷卻至(70±2)℃，按底物中淀粉含量計(jì)算加入中溫α-淀粉酶進(jìn)行液化，液化完全后，降溫至(58±2)℃，調(diào)節(jié)pH(5．0±0．2)，按100 U/g原料加入糖化酶，糖化60 min后過濾得提取液，測(cè)定提取液中粗多糖含量，以粗多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳料液比。

1．2．4．2 液化時(shí)間的確定

采用最佳料液比進(jìn)行調(diào)漿，85 ℃糊化30 min后冷卻至(70±2)℃，按底物中淀粉含量分別加入中溫α-淀粉酶進(jìn)行液化試驗(yàn)，分別液化20、30、40、50、60 min，采用碘液檢測(cè)判定是否通過液化終點(diǎn)，以確定最佳液化時(shí)間。

1．2．4．3 不同糖化酶添加量對(duì)多糖得率的影響

采用上述最佳料液比調(diào)漿，經(jīng)糊化、完全液化后降溫至(58±2)℃，調(diào)節(jié)pH(5．0±0．2)，分別按50、75、100、125、150 U/g原料加入糖化酶進(jìn)行試驗(yàn)，糖化60 min后過濾得提取液，測(cè)定提取液中粗多糖含量，以粗多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳糖化酶添加量。

1．2．4．4 不同糖化時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

采用上述最佳料液比調(diào)漿，經(jīng)糊化、完全液化后降溫至(58±2)℃，調(diào)節(jié)pH(5．0±0．2)，按上述糖化酶最佳添加量進(jìn)行糖化試驗(yàn)。糖化時(shí)間分別取30、45、60、75、90 min進(jìn)行試驗(yàn)，糖化后滅酶、過濾得提取液，測(cè)定提取液中粗多糖含量，以粗多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳糖化時(shí)間。

1．2．4．5 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇料水比、糖化酶添加量、糖化時(shí)間作為考察因素，以提取液中粗多糖得率作為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)確定最佳糖化工藝條件。

1．2．4．6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用最佳的糖化工藝條件，以500 g薏米投料量進(jìn)行3批次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，通過對(duì)提取液中粗多糖得率的測(cè)定結(jié)果分析，驗(yàn)證最佳糖化工藝條件。

1．2．5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS和Excel軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同料液比對(duì)粗多糖得率的影響

稱取50 g薏米粉，分別采用1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30料液比進(jìn)行調(diào)漿，85 ℃糊化30 min后冷卻至(70±2)℃，按25 U/g原料加入中溫α-淀粉酶，液化完全后，降溫至(58±2)℃，調(diào)節(jié)pH(5．0±0．2)，按100 U/g原料加入糖化酶，糖化60 min后滅酶、過濾得薏米提取液，測(cè)定提取液中粗多糖含量，結(jié)果如圖1示：

由圖1可知，隨著加水比的增加，提取液中粗多糖得率逐漸增加，當(dāng)料液比為大于1∶20后，粗多糖得率增加不顯著。因酶解液含水量過少，不足以溶解所有多糖，增加加水比后，多糖溶解量增大，當(dāng)加水量到一定程度后，溶解的多糖量不再提高，從實(shí)際生產(chǎn)操作和成本考慮，加水量不宜過大，故確定最佳料液比為1∶20。

圖1 料液比對(duì)粗多糖得率的影響

2.2 最佳液化時(shí)間的確定

稱取50 g薏米粉，采用1∶20料液比進(jìn)行調(diào)漿，85 ℃糊化30 min后冷卻至(70±2)℃，加入中溫α-淀粉酶25 U/g原料進(jìn)行液化試驗(yàn)，分別于20、30、40、50、60 min采用碘液檢測(cè)，以酶解液變色情況判定是否通過液化終點(diǎn)，結(jié)果如表1：

由表1可看出：隨著液化時(shí)間的增加，酶解液遇碘變色逐漸變淡，當(dāng)液化時(shí)間超過40 min時(shí)，酶解液遇碘呈淡棕黃色，表明已達(dá)液化終點(diǎn)。故確定最佳液化時(shí)間為40 min。

2.3 不同糖化酶添加量對(duì)粗多糖得率的影響

采用1∶20料液比調(diào)漿，85 ℃糊化30 min后冷卻至(70±2)℃，加入中溫α-淀粉酶25 U/g原料液化40 min后降溫至(58±2)℃，調(diào)節(jié)pH(5．0±0．2)，分別按50、75、100、125、150 U/g原料加入糖化酶進(jìn)行試驗(yàn)，糖化60 min后滅酶、過濾得薏米提取液，測(cè)定提取液中粗多糖含量，結(jié)果如圖2所示：

由圖2可知，隨著糖化酶添加量的增加，粗多糖得率逐漸增加，當(dāng)糖化酶添加量超過100 U/g時(shí)，粗多糖得率增加不顯著。在酶促反應(yīng)中，當(dāng)?shù)孜餄舛葹楣潭ㄖ禃r(shí)，隨著酶添加量的增加，生成物越多；當(dāng)?shù)孜锶勘幻阜纸猓赣昧坷^續(xù)增加，生成物不再變化。故確定最佳糖化酶添加量為100 U/g原料。

表1 酶解液變色情況表

圖2 糖化酶添加量對(duì)粗多糖得率的影響

2.4 不同糖化時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

稱取50 g薏米粉，采用1∶20料液比調(diào)漿，85 ℃糊化30 min后冷卻至(70±2)℃，加入中溫α-淀粉酶25 U/g原料液化40 min后降溫至(58±2)℃，調(diào)節(jié)pH(5．0±0．2)，糖化酶添加量為100 U/g原料進(jìn)行糖化試驗(yàn)。糖化時(shí)間分別取30、45、60、75、90 min進(jìn)行提取試驗(yàn)，滅酶、過濾得薏米提取液，測(cè)定提取液中粗多糖含量，結(jié)果如圖3所示：

由圖3可知，隨著糖化時(shí)間的增加，粗多糖得率逐漸增加，當(dāng)糖化時(shí)間超過60 min時(shí)，粗多糖得率增加不顯著。這說明產(chǎn)物溶解受時(shí)間的影響，時(shí)間過短粗多糖溶出量少，時(shí)間過長(zhǎng)又容易引起粗多糖分解，故確定最佳糖化時(shí)間為60 min。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝

在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇料水比、糖化酶添加量、糖化時(shí)間作為考察因素，以粗多糖得率作為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)確定最佳酶解工藝條件。選用L9（33）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果見表2、表3。

圖3 糖化時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

通過正交分析，由表3可看出：極差RB＞RC＞RA，說明糖化酶添加量對(duì)薏米提取液中粗多糖得率的影響最大，其次是糖化時(shí)間，料液比對(duì)薏米提取液中粗多糖得率的影響最小，即影響粗多糖得率的各因素主次順序?yàn)锽＞C＞A，且較優(yōu)方案為A2B2C2。即：料液比1∶20、糖化酶添加量100 U/g原料、糖化時(shí)間60 min。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 正交試驗(yàn)表

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳工藝，以500 g投料量進(jìn)行3批次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，對(duì)中試成品粗多糖含量進(jìn)行檢測(cè)，3批次實(shí)驗(yàn)成品的粗多糖得率分別為1．92%、1．97%、1．95%，平均值為1．95%；結(jié)果表明：3批次的多糖得率與正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果基本相符。

3 結(jié)論

采用以薏米為原料，糊化后經(jīng)中溫α-淀粉酶液化完全、采用糖化酶酶解提取制備化妝品用薏米提取液，其工藝合理可行。最佳工藝為：以薏米為原料，料液比為1∶20、85 ℃糊化30 min、淀粉酶用量25 U/g原料、液化溫度(70±2)℃、液化時(shí)間40 min；糖化酶用量100 U/g原料、糖化pH(5．0±0．2)、糖化溫度(58±2)℃、糖化時(shí)間60 min；糖化結(jié)束后加熱至95 ℃滅酶10 min，經(jīng)過濾、澄清，取上清液經(jīng)硅藻土、膜過濾，加熱至90 ℃灌裝封口，后經(jīng)85 ℃殺菌40 min、冷卻至室溫得薏米提取液成品。產(chǎn)品呈無色清亮透明，粗多糖得率達(dá)1．92%以上。

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