電針運(yùn)動(dòng)區(qū)對(duì)MCAO大鼠大腦皮質(zhì)及血清內(nèi)NGF和VEGF表達(dá)的影響※

馬 英 楊春壯 雷 瀛 王子軒 張志遠(yuǎn) 王思佳 曹雪雪 趙婷婷 劉 星

（牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

缺血性腦中風(fēng)因“四高”（高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率和高復(fù)發(fā)率）對(duì)人類生命安全和健康造成嚴(yán)重危害，因此一直以來(lái)是基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的重點(diǎn)、熱點(diǎn)和難點(diǎn)。頭針是一種行之有效的治療方法，其蘊(yùn)含有巨大的科學(xué)內(nèi)涵和實(shí)踐價(jià)值，尤其是簡(jiǎn)、便、廉、無(wú)任何毒副作用的特點(diǎn)是任何其它方法都難以企及的。本研究通過(guò)動(dòng)態(tài)觀測(cè)電針運(yùn)動(dòng)區(qū)對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞 （middle cerebral artery occlusion，MCAO） 大鼠大腦皮質(zhì)及血清內(nèi)NGF和VEGF含量的影響入手，探討其治療機(jī)制，將為臨床應(yīng)用頭針治療缺血性中風(fēng)提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑和藥物 Multiskan MK3酶標(biāo)儀（Thermo熱電上海儀器有限公司）；神經(jīng)生長(zhǎng)因子β（NGFβ）酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢博士德生物公司）；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢博士德生物公司）。

1.2 MCAO大鼠模型的制作 選取健康Wistar大鼠72只，雌雄各半，體質(zhì)量200～350 g[由牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXX(黑)2015-007]。首先將大鼠以10% 水合氯醛 （0.3 mL/100 g） 腹腔注射麻醉，仰臥固定于鼠板上，在大鼠頸部前正中線縱行切口，長(zhǎng)約2.0～2.5 cm，鈍性分離筋膜、肌肉及甲狀腺腺體，注意減少刺激迷走神經(jīng)，分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），再穿一線備用。分離頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）和頸外動(dòng)脈（ECA），結(jié)扎ECA，用微動(dòng)脈夾夾閉ICA，在近CCA分叉處剪一“V”字型切口，將直徑為0.2～0.25 mm尼龍線頭端涂抹硅膠脂，沿CCA插入ICA，同時(shí)放開(kāi)微動(dòng)脈夾，輕輕牽拉使栓線進(jìn)入顱腔，插入深度18～20 mm，稍遇阻力即停，說(shuō)明線栓已阻斷大腦中動(dòng)脈（MCA）的入口，造成MCA阻塞。將CCA上的備線扎緊，防止線栓滑出，縫合傷口，涂抹青霉素抗炎。1h后，緩慢退出部分線栓進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組只做手術(shù)暴露頸部動(dòng)脈，結(jié)扎CCA，但不予線栓。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組 隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和電針組，每組各24只。

1.3.2 針刺操作 術(shù)后大鼠清醒即開(kāi)始針刺。

取穴及針刺方法:運(yùn)動(dòng)區(qū)：即百會(huì)穴透太陽(yáng)穴，頂骨正中斜刺向耳前方。行雙側(cè)針刺并加電針，采用G6805-Ⅱ型電針治療儀。每天1次，每次30 min，疏密波，5～30 HZ，強(qiáng)度為以大鼠能耐受為度。模型組和假手術(shù)組自然飼養(yǎng)，不作特殊處理。

1.3.3 樣本采集 各組動(dòng)物分別于治療第3天、7天、14天后禁食過(guò)夜，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取8只，先行尾靜脈采血，然后迅速處死取腦，在冰盤(pán)上修取右側(cè)（缺血側(cè)）MCA供血區(qū)的大腦皮質(zhì)，用濾紙清除掉黏附的腦脊液和血液，稱重標(biāo)記后按1∶9的比例配入冰生理鹽水，置于勻漿器勻漿，血及腦組織再于離心機(jī)以3000 r/min離心30 min，取上清用酶聯(lián)免疫法測(cè)NGF和VEGF。

1.4 神經(jīng)功能障礙評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 在治療第3天、7天、14天后處死前分別進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)；1分：癥狀為提尾懸空時(shí)左前爪不能伸展；2分：癥狀為行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：癥狀為行走困難，并不時(shí)地向左側(cè)傾倒；4分：癥狀為不能自主行走，意識(shí)下降。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示。采用單因素方差分析進(jìn)行多組間均數(shù)比較。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的比較 （x±s，分）

2.2 3組大鼠大腦皮質(zhì)NGF含量比較 見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠大腦皮質(zhì)NGF OD值比較 （x±s）

2.3 3組大鼠大腦皮質(zhì)VEGF含量比較 見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠大腦皮質(zhì)VEGF OD值比較 （x±s）

2.4 3組大鼠血清NGF含量比較 見(jiàn)表4。

表4 3組大鼠血清NGF OD值比較 （x±s）

2.5 3組大鼠血清VEGF含量比較 見(jiàn)表5。

表5 3組大鼠血清VEGF OD值比較 （x±s）

3 討論

中風(fēng)是中醫(yī)“風(fēng)、癆、鼓、膈”四大難證之一[1]。其病理機(jī)制為肝腎陰虛，肝亢風(fēng)動(dòng)，氣血逆亂，上沖犯腦[2]?，F(xiàn)代學(xué)者們研究認(rèn)為[3]，腦神經(jīng)具有可塑性是中風(fēng)后功能恢復(fù)的關(guān)鍵機(jī)制。程燕等[4]總結(jié)：唐宋前多“內(nèi)虛邪中”立論，唐宋后多“內(nèi)風(fēng)”立論。治療原則有養(yǎng)陰通督、調(diào)理髓海、通陽(yáng)柔筋、解絀緩急、宣通氣血、治督健腦、陰陽(yáng)調(diào)衡、益腎調(diào)督、健脾化瘀、醒腦開(kāi)竅等。督脈為奇經(jīng)八脈之一，是全身諸陽(yáng)之總匯，被稱為“諸陽(yáng)總督”，督脈還有溝通陰陽(yáng)，總攝諸經(jīng)之能力，因此，“病變?cè)谀X，首取督脈”為治療腦缺血性疾病的首選，百會(huì)穴位于督脈之頂，內(nèi)絡(luò)于腦，是各經(jīng)脈所集之處，為督脈益智要穴[5]。本研究選取運(yùn)動(dòng)區(qū)即百會(huì)穴透太陽(yáng)穴，于此行焦氏頭針有醒神開(kāi)竅，安神定志，平肝熄風(fēng)的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，MCAO大鼠可引起大腦皮層和紋狀體支配的對(duì)側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)障礙，主要表現(xiàn)在肌力和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性下降，前肢使用不對(duì)稱及感覺(jué)減退或異常，完全符合臨床上的偏癱、偏身感覺(jué)障礙等表現(xiàn)[6]。本研究中假手術(shù)組大鼠均未出現(xiàn)神經(jīng)受損體征，MCAO術(shù)后出現(xiàn)以四肢遠(yuǎn)端為主的不同程度神經(jīng)功能障礙，如肌張力下降，提尾左前爪內(nèi)收屈曲，行走時(shí)向左轉(zhuǎn)圈或向左傾倒，與臨床缺血性腦中風(fēng)體征相似。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)針刺14 d后，電針組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于模型組（P<0.01），而針刺3 d、7 d時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分無(wú)明顯差異。提示電針運(yùn)動(dòng)區(qū)能夠改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能，具有神經(jīng)保護(hù)作用，但同時(shí)也需要一定的作用時(shí)間才可見(jiàn)效。

NGF[7]通過(guò)與其特異性Trk A受體結(jié)合，參與調(diào)節(jié)交感及感覺(jué)神經(jīng)元的分化、成熟過(guò)程，具有促進(jìn)神經(jīng)元的生存，調(diào)節(jié)突觸效力和可塑性的作用[8-9]。有研究表明NGF對(duì)損傷神經(jīng)元具有保護(hù)和修復(fù)作用。在正常狀態(tài)下，外源性NGF靜滴或肌注后不易透過(guò)血腦屏障，但在腦梗死急性期，由于血腦屏障受損，NGF可透過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本研究發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)NGF表達(dá)在術(shù)后無(wú)明顯差異，模型組在術(shù)后第3天開(kāi)始表達(dá)升高，第7天達(dá)到高峰，接近假手術(shù)組的水平，到第14天表達(dá)下降。這一結(jié)果提示，腦缺血后可以引起內(nèi)源性NGF表達(dá)增加，這種變化是神經(jīng)細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制。但其增加時(shí)程較短，難以對(duì)受損神經(jīng)元起到全面持久的保護(hù)作用。與模型組比較，電針組不同時(shí)間點(diǎn)的大腦皮質(zhì)和血清內(nèi)NGF表達(dá)顯著升高（P<0.001，P<0.01），說(shuō)明針刺能促使腦缺血大鼠內(nèi)源性NGF產(chǎn)生量增加、產(chǎn)生時(shí)限延長(zhǎng)，進(jìn)而保護(hù)和修復(fù)受損神經(jīng)。NGF對(duì)神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)，可能與其促進(jìn)病灶區(qū)神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的再生、促進(jìn)受損神經(jīng)組織蛋白、核酸和脂質(zhì)的合成及糖的利用并維持再生神經(jīng)元的功能有關(guān)。

VEGF具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移，增加血管通透性和加速新生血管形成的作用[10-11]。有學(xué)者報(bào)道[12]，VEGF能夠舒張血管平滑肌，刺激恢復(fù)血流，進(jìn)而保護(hù)缺血性損傷的腦組織。還有研究報(bào)道，早期血清VEGF的含量增加，可建立或開(kāi)放側(cè)支循環(huán)，增加缺血組織的供血供氧，調(diào)動(dòng)處于休眠狀態(tài)的腦細(xì)胞進(jìn)入功能狀態(tài)，發(fā)揮代償作用，使已喪失的神經(jīng)功能重現(xiàn)。另外血清VEGF屬于始發(fā)因素，可不依賴于血管的形成而直接發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，這有助于改善神經(jīng)細(xì)胞的存活并利于發(fā)揮功能。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，模型組大腦皮質(zhì)和血清中VEGF的含量都逐漸呈現(xiàn)下降趨勢(shì)且顯著低于假手術(shù)組（P<0.001），電針組雖然仍低于假手術(shù)組，但與模型組相比，大腦皮質(zhì)和血清中VEGF含量呈上升趨勢(shì)，且在針刺第14天時(shí)有較顯著差異（P<0.01，P<0.05），電針運(yùn)動(dòng)區(qū)能刺激VEGF的增加，且時(shí)間越久，越有利于VEGF的生成，其腦保護(hù)作用可能與誘導(dǎo)腦缺血大鼠VEGF的高表達(dá)，促進(jìn)缺血區(qū)的血管新生及側(cè)支循環(huán)的建立，維系和改善病理狀態(tài)下的微環(huán)境相關(guān)。這也驗(yàn)證了神經(jīng)功能評(píng)分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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