典型熒蒽降解菌的固定化方法優(yōu)選及降解性能

張朝暉, 左宇環(huán)，李騰飛，吳降麟，陳萌萌，岳喜明

（1.天津工業(yè)大學 環(huán)境與化學工程學院，天津 300387；2.天津工業(yè)大學 省部共建分離膜與膜過程國家重點實驗室，天津 300387）

多環(huán)芳烴（PAHs）是廣泛存在于水環(huán)境中的一類典型持久性有機污染物（POPs）[1]，PAHs對生物生存和人類健康構(gòu)成很大威脅，中國、美國及歐洲都將多種PAHs列入環(huán)境優(yōu)先檢測的“黑名單”[2-4].由于PAHs具有高脂溶性和相對低的水溶性，往往在水體中含量較低，易與懸浮物結(jié)合而沉降，因此水體底泥也成為PAHs主要的環(huán)境歸宿之一[5-6]，我國一些主要河流、湖泊的底泥沉積物中都廣泛存在著PAHs污染問題[7-11]，其中4環(huán)以上的高分子質(zhì)量PAHs，如熒蒽、芘、苯并（a）芘等[12-13]，因其難降解性和更高的毒性，成為PHAs污染修復的關(guān)鍵.

針對底泥沉積物環(huán)境，近年來有專家學者提出對高效降解菌經(jīng)過固定化技術(shù)：將菌種固定在限定的空間區(qū)域以內(nèi)，可以避免其他惡性環(huán)境對降解菌的毒害，增加降解菌的密度，從而能在復雜環(huán)境中進一步提高降解菌的降解效率[14-15].范玉超等[16]采用竹炭吸附蒼白桿菌（Ochrobactrum sp．AHAT-3）并輔以海藻酸鈉包埋，所得到的固定化顆粒在28 d內(nèi)對砂姜黑土和紅壤中阿特拉津的降解率分別為51.9%和52.8%，均比添加游離菌的試驗組高出約10%.Su等[17]將固定真菌吸附在玉米棒上修復污染的土壤，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過固定化的真菌對環(huán)境有更好的適應力，而且反應啟動速度比沒固定化的更快.王鑫等[18]研究土壤中的苯并（a）芘降解動態(tài)表明，以蛭石為載體吸附固定化混合菌，不僅有良好的傳質(zhì)性，其苯并（a）芘對的降解率也要比有利菌高大約20個百分點.這些研究都表明固定化技術(shù)能夠增強降解菌的降解效率.

本文采用2種固定化方法，對熒蒽降解菌青霉素菌DTQ-HK1進行固定化，通過比較固定化載體對降解菌的影響和菌種經(jīng)過固定化處理之后對熒蒽的降解效果，篩選出最佳固定化方法后，進一步研究降解菌經(jīng)過最佳固定化方法處理后對液相和底泥中熒蒽降解效率的影響.

1 實驗部分

1.1 實驗材料

實驗菌種為實驗室從河道底泥中植物根際圈中篩選出的典型高效熒蒽降解菌青霉素菌DTQ-HK1.實驗底泥取自天津大沽排污河淺水區(qū)表層底泥.吸附固定化載體為不同粒徑的玉米芯、活性炭和天然沸石，包埋固定化則以聚乙烯醇（PVA）和海藻酸鈉（SA）作為包埋載體材料.

1.2 培養(yǎng)基組成

無機鹽培養(yǎng)基（MSM培養(yǎng)基）組成（每升）：硫酸銨1 g，磷酸二氫鉀0.8 g，磷酸氫二鉀0.2 g，氯化鎂0.05 g，氯化鈣 0.05 g，氯化鐵 0.01 g，氯化鈉 5 g，溶于超純水，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7，于121℃滅菌20 min.

1.3 菌種固定化過程

吸附固定化過程：將菌種接種到無機鹽液體培養(yǎng)基，置于28℃、120 r/min恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后，調(diào)整菌液濃度為OD600值為1，將OD600值為1的菌液與破碎后不同粒徑的吸附固定化載體按照v∶m=50∶1混合、30℃、120 r/min條件下振蕩吸附24 h，使微生物吸附掛膜，制成吸附固定化菌.

包埋固定化過程：按照上述菌液和載體的比例，將菌液在3 000 r/min、離心5 min后收集濃縮菌液1 mL，與包埋載體材料混合后，滴制成包埋小球，用去離子水沖洗干凈，置于4℃保存，制成包埋固定化菌.

1.4 液相中熒蒽的提取測定

取待測樣品于250 mL分液漏斗中，分3次向其中加入50 mL的乙酸乙酯，每次震蕩3 min.收集3次萃取提取液，過無水硫酸鈉去除水分后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2mL左右，加入一定量甲醇進行溶劑替換后于50mL容量瓶定容，取一定量溶液于樣品瓶中.利用高效液相色譜測定熒蒽的含量，高效液相色譜工作條件：檢測波長 324 nm，色譜柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），柱溫30℃，流動相為甲醇，流速1 mL/min，進樣量為20 μL.

1.5 固定化處理對菌種抗環(huán)境沖擊能力的影響實驗

將2 g吸附菌種后的玉米芯，分別置于溫度為4、20、25、30、35、40 和 45 ℃，pH 值分別為 4、5、6、7、8 和10，以及 Zn2+、Cu2+質(zhì)量濃度分別為 0、20、100 和 500 mg/L的50 mL無機鹽液體培養(yǎng)基中（熒蒽初始質(zhì)量濃度為50 mg/L），分別另設一組對照組，只投加等量懸浮菌，2組實驗組在相同條件下，于（30±1）℃（除溫度實驗外）、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7 d后，測定培養(yǎng)液中菌種脂磷的含量.

1.6 微生物量的測定

本實驗采用脂磷法測定培養(yǎng)過程中吸附固定化菌微生物量，以磷酸鹽濃度表示.取待測生物量的吸附固定化菌液于4 000 r/min離心5 min后過0.45 μm濾膜減少液體含量，將待測物置于50 mL具塞三角瓶中，加入體積比為1∶2∶0.8的氯仿、甲醇和水的萃取混合液19 mL，用力振搖10 min，靜止12 h.向三角瓶中加入氯仿和水各5 mL，使得最終氯仿∶甲醇∶水為1∶1∶0.9，靜置12 h，取出含有脂類組分的下層氯仿相5 mL轉(zhuǎn)移至10 mL具塞刻度試管，水浴蒸干，向試管中加入0.8 mL 5%過硫酸鉀溶液，并加水至10 mL刻度，在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)121℃消解30 min，對照制作的脂磷標準曲線測定消解液中的磷酸鹽濃度[19].

1.7 液相中吸附固定化菌對熒蒽的長期降解實驗

取2 g制備好的吸附固定化載體吸附菌種后，加入到50 mL熒蒽質(zhì)量濃度為100 mg/L的無機鹽培養(yǎng)液中，另設一組對照組，相同條件下，加入等量懸浮菌，2組實驗樣品于（30±1）℃、120 r/min的恒溫搖床中避光振蕩42 d，培養(yǎng)期間每7 d取樣一次測定液相中熒蒽含量.

1.8 吸附固定化菌-植物對底泥中熒蒽的降解實驗

將取自天津大沽排污河的底泥風干，過篩后用高效液相色譜儀測定底泥中熒蒽的含量，為了方便實驗和檢測，人為投加熒蒽使底泥中熒蒽含量穩(wěn)定在100 mg/kg，并將根系發(fā)達的水生植物菖蒲以盆栽的方式種植到被熒蒽污染的底泥中，并且向菖蒲根際底泥中投加50 mL懸浮菌和制備好的吸附固定化菌，每隔15 d測定底泥中剩余熒蒽濃度.

1.9 底泥中熒蒽的提取

取適量測試底泥，風干后研磨，過80目篩備用.取5 g處理好的干泥于離心管中，向其中加入20 mL萃取劑：二氯甲烷∶正己烷（V∶V）=1∶1，放置于超聲儀中超聲30 min，再置于離心機中2 000 r/min離心5 min，收集上清液于圓底燒瓶中，上述過程重復3次.將3次收集到的上清液進行濃縮凈化定容后，取一定量溶液于樣品瓶中，利用高效液相色譜測定熒蒽的含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化處理對菌種耗氧速率的影響分析

本實驗采用菌種耗氧速率表征固定化處理之后對菌種微生物活性的影響，用BOD測試儀對吸附固定化菌和包埋固定化菌進行10 d耗氧量測定，得到菌種耗氧速率圖，結(jié)果如圖1所示.

圖1 吸附和包埋固定化菌耗氧速率Fig.1 Oxygen consumption rate of immobilized strain by adsorption and embedment

圖 1（a）、（b）、（c）分別為經(jīng)過 3 種粒徑的 3 種吸附載體固定化處理后的菌種耗氧速率圖.圖1（a）顯示玉米芯粒徑為10目的耗氧速率最高為102 mg/（g·d），比空白組高出25 mg/（g·d）；圖1（b）顯示活性炭粒徑為10目為79 mg/（g·d），比空白組高3 mg/（g·d）；圖1（c）顯示沸石粒徑為40～60目耗氧速率最高68 mg/（g·d），但比空白組低6 mg/（g·d）.3種載體中玉米芯相比于空白組對菌種的耗氧速率有了極大的提升，原因可能是玉米芯本身屬于植物殘體，能夠給菌種生長提供有利的微環(huán)境，且玉米芯在水中對菌種有一定粘性，對菌種吸附富集作用較強，從而能使菌種生命活動更加活躍，而活性炭對菌種耗氧速率影響不明顯，沸石對菌種耗氧速率有抑制作用，原因可能是沸石空隙中有其他復雜成分對微生物活性有抑制作用.上述說明3種吸附載體中玉米芯是對微生物活性最有利的載體，其中10目粒徑的玉米芯對菌種耗氧速率影響最有利.

圖1（d）顯示，經(jīng)過3種不同配比的包埋材料固定化處理的菌種10 d耗氧速率中，配比為2%PVA+3%SA的耗氧速率最高為82 mg/（g·d），相比空白組提高8 mg/（g·d），說明2%PVA+3%SA對菌種耗氧速率有增強作用.而6%PVA+2%SA和10%PVA+0.5%SA對菌種耗氧速率有抑制作用，原因可能是由于PVA濃度越高對微生物活性的抑制作用越強，同時PVA濃度越高包埋固定化小球機械強度越高，影響菌種耗氧速率.

2.2 固定化載體的引入對熒蒽測定過程的干擾分析

由于所選載體具有豐富的孔徑和比表面積，對有機物都有一定的吸附性能，所以試驗過程中可能存在由于載體對熒蒽的不可逆吸附導致對菌種降解熒蒽效率的誤判.為了確定固定化載體自身吸附熒蒽對其生物降解效率測定是否會產(chǎn)生干擾，對上述最佳吸附和包埋固定化載體分別進行吸附和提取實驗.吸附和包埋固定化載體在濃度為200 mg/L的熒蒽溶液中經(jīng)過10 h的振蕩吸附之后對體系中熒蒽進行提取，結(jié)果如圖2所示.

圖2 固定化載體對熒蒽吸附后的提取量Fig.2 Fluoranthene extraction from immobilized carriers after adsorption

由圖2可知，無固定化載體、粒徑10目的玉米芯、2%PVA+3%SA對熒蒽吸附后的提取量分別為173.56、172.34、170.34 mg/L，相比于無固定化載體的提取量，吸附固定化載體和包埋固定化載體與空白組熒蒽提取量分別相差1.22、3.22 mg/L，偏差極小，說明吸附和包埋載體在高濃度熒蒽溶液中經(jīng)過10 h吸附后，體系中的熒蒽基本能夠被提取出來，說明載體自身對熒蒽的不可逆吸附造成的干擾是不明顯的.

2.3 固定化處理對菌種降解熒蒽過程的影響

選擇上述吸附和包埋固定化中菌種耗氧速率最佳的載體材料，對菌種進行吸附和包埋固定化，將固定化菌投加到熒蒽溶液中，經(jīng)過14 d的熒蒽降解實驗，研究降解菌的不同固定化方式對熒蒽降解過程的影響，結(jié)果如圖3所示.

由圖3可見，經(jīng)過14 d熒蒽降解實驗，包埋固定化菌對溶液中熒蒽降解率僅為23.49%，比懸浮菌提高了3.88%，而吸附固定化菌對熒蒽的降解率達到了28.28%，比懸浮菌提高了8.67%，相比而言，吸附固定化菌對熒蒽降解效果比包埋固定化效果更好，原因可能是在相比于包埋固定化載體，液相中吸附固定化載體能使菌種保持較高的微生物活性，從而能夠?qū)奢毂３指叩慕到庑?所以在本實驗中，對于2種固定化處理對熒蒽降解的增效作用而言，吸附固定化比包埋固定化更有利于熒蒽降解菌對熒蒽的降解，能夠在一定程度上提高熒蒽的降解效率.

圖3 菌種不同固定化方式對熒蒽降解過程的影響Fig.3 14-day degradation rate of fluoranthene by adsorption and embedment immobilized strain

2.4 固定化處理對菌種抗環(huán)境沖擊能力的影響

菌種負載到固定化載體上后，理論上來說載體能夠?qū)N起到一定的保護作用，從而提高菌種的耐環(huán)境沖擊能力.為此本實驗選用對菌種生長最有利的10目玉米芯作為固定化載體，對比了載體固定化后菌種和沒有載體保護的懸浮菌在外界環(huán)境變化沖擊下的生長情況.

2.4.1 溫度波動對吸附固定化菌增殖速率的影響

7 d培養(yǎng)后的懸浮菌和吸附固定化菌增殖速率的測定結(jié)果（脂磷法）如圖4所示.

圖4 溫度對吸附固定化菌增殖速率的影響Fig.4 Multiplication rate of adsorption immobilized strain in different temperatures

由圖4可見，吸附固定化菌和懸浮菌的生長狀況都受溫度變化影響明顯.4℃低溫條件下菌種生長都較緩慢，隨著溫度的上升菌種增殖速率有了較大的提升，當溫度達到30℃時，增殖速率達到最大，說明30℃是青霉素菌DTQ-HK1的最適溫度.溫度進一步升高后增殖速率下降，說明高溫會抑制菌種的生長.但是在相同溫度條件下，懸浮菌對溫度變化更加敏感，吸附固定化菌在同樣不利的溫度條件下菌種增殖速度仍然大于懸浮生長菌，說明吸附固定化載體對菌種有一定的保護作用，能夠在一定程度上減少不利的溫度條件給菌種帶來的負面影響.

2.4.2 pH值變化對吸附固定化菌增殖速率的影響

對吸附固定化菌和懸浮菌在不同pH值條件下的菌種增殖速率測定結(jié)果（脂磷法）如圖5所示.

圖5 pH值對吸附固定化菌增殖速率的影響Fig.5 Multiplication rate of adsorption immobilizedstrain in different pH value

由圖5可見，pH值變化對吸附固定化菌和懸浮菌的生長影響明顯，懸浮菌在pH值小于5和pH值大于9的條件下菌株幾乎不能生長，但是吸附固定化菌在2種范圍的pH條件下能夠有效地生長，說明吸附固定化載體能夠保護菌種，使菌種更耐酸堿.而吸附固定化菌和懸浮菌在pH值為6～8范圍內(nèi)生長良好，其中在pH為7時增殖速率達到最高，生長狀況最好.因此，菌種生長最適pH為7.

2.4.3 重金屬對吸附固定化菌增殖速率的影響

由于底泥吸附能力較強，能夠富集水體中重金屬，因而在配置無機鹽培養(yǎng)液的過程中分別加入了Zn2+、Cu2+，考察 Zn2+、Cu2+對吸附固定化菌及懸浮菌增值速率的影響，測定結(jié)果（脂磷法）如圖6所示.

圖6 重金屬對吸附固定化菌增殖速率的影響Fig.6 Effects of heavy metals on multiplication rate of adsorption immobilized strain

由圖6可見，吸附固定化菌和懸浮菌對Zn2+、Cu2+都有一定抵抗性，當Zn2+、Cu2+的投加質(zhì)量濃度為20 mg/L時菌種生長只是受到輕微抑制，而后隨著Zn2+、Cu2+投加濃度的升高吸附固定化菌和懸浮菌增殖速率都有所降低，但是吸附固定化菌明顯比懸浮菌對重金屬更具有耐受性，相同條件下，吸附固定化菌具有更高的增殖速率；其中Cu2+對吸附固定化菌和懸浮菌的毒害作用明顯強于Zn2+，當Zn2+質(zhì)量濃度為500 mg/L時有無固定化處理的菌種活性都有所較低，生長較緩慢，當Cu2+質(zhì)量濃度達到500 mg/L時懸浮菌幾乎難以正常生長，但是吸附固定化菌只是生長受到抑制作用，這也進一步說明在不利外部環(huán)境下，固定化載體能夠?qū)N起到保護作用，能夠保護菌種不受外部不利條件的毒害.

2.5 最佳固定化技術(shù)對菌種連續(xù)降解液相中熒蒽效率的影響

經(jīng)過對2種固定化處理方式的對比，為此本實驗選擇2種固定化方式最佳的吸附固定化，且選用吸附固定化中10目的玉米芯作為最佳固定化載體對熒蒽高效降解菌種進行吸附固定化，并對液相中熒蒽進行42 d的連續(xù)性長期降解實驗，結(jié)果如圖7所示.

圖7 最佳固定化技術(shù)對菌種連續(xù)降解液相中熒蒽的效果Fig.7 Effects of optimal immobilized method on degradation rate of fluoranthene by strain in liquid

由圖7可知，經(jīng)過42 d實驗，懸浮菌對熒蒽的降解率達到52.22%，而吸附固定化菌對熒蒽的降解率達到62.45%，提高了10.23%，說明懸浮菌經(jīng)過吸附固定化后能夠明顯提高熒蒽降解菌對熒蒽的降解效率，由于吸附固定化載體具有豐富的孔徑，對熒蒽具有吸附富集效應，從而為固定于載體上的菌種提供了一個基質(zhì)豐富的微環(huán)境，有利于菌種對熒蒽的生物降解過程，同時玉米芯本身有營養(yǎng)物質(zhì)，也能夠為菌種提供一定的生存基質(zhì)，進一步保障菌種的活躍性.

2.6 吸附固定化菌和植物聯(lián)合降解底泥中熒蒽的效果

本實驗選擇河道常見的根系發(fā)達的挺水植物，且經(jīng)過試驗確定對熒蒽具有較高降解效率的菖蒲作為底泥中熒蒽的修復植物，在此基礎(chǔ)上，進一步研究固定化處理后的典型熒蒽降解菌，在植物根際圈作用下對底泥中熒蒽的90 d的長期降解效果，結(jié)果如圖8所示.

由圖8可知，經(jīng)過90 d的實驗,菖蒲對底泥中熒蒽的降解效率為55.35%，而通過投加典型熒蒽降解菌能夠使底泥中熒蒽降解率提高到80.58%，將降解菌進行吸附固定化處理后能夠使底泥中熒蒽的降解率達到86.14%，吸附固定化菌比懸浮菌對底泥中熒蒽的降解率提高了5.56%，說明吸附固定化處理有利于菌種對底泥中熒蒽的降解，由于底泥中環(huán)境復雜，而吸附固定化載體能夠吸附降解菌，為降解菌提供有利的生存環(huán)境，同時能夠使降解菌在有毒有害環(huán)境中具有一定的抗沖擊能力，提高降解菌的存活能力，從而提高降解菌對熒蒽的降解效果.

圖8 最佳固定化技術(shù)對菌種降解底泥中熒蒽的效果Fig.8 Effect of optimal immobilized method on degradation rate of fluoranthene by strain in river sediment

3 結(jié)論

（1）經(jīng)過10 d的耗氧速率測定，3種吸附載體中粒徑為10的玉米芯載體固定化菌種的耗氧速率最高為102 mg/（g·d），3種配比中，2%PVA+3%SA包埋固定化菌種耗氧速率最高為82 mg/（g·d）；對固定化方法中的菌種耗氧速率最佳載體進行14 d的熒蒽降解實驗，包埋固定化菌對溶液中熒蒽降解率為23.49%，吸附固定化菌對熒蒽的降解率達到了28.28%；上述結(jié)果說明菌種經(jīng)過吸附固定化對菌種活性和熒蒽的降解效率都比包埋固定化效果好.

（2）菌種經(jīng)過吸附固定化處理能夠增強菌種在不同溫度變化下的承受能力，且固定化菌最適生長溫度為30℃；不同pH變化下，固定化菌比懸浮菌增殖速率更高，并且能在強酸強堿條件下，保持較高的增殖速率；在有重金屬存在的條件下，固定化載體能夠給菌種提供保護，降低重金屬離子對菌種的毒害作用，保持較高的增殖速率.

（3）經(jīng)過吸附固定化菌對液相中42 d的長期降解，吸附固定化菌對熒蒽的降解率達到62.45%，比懸浮菌提高了10.23%，說明菌種經(jīng)過吸附固定化能夠顯著提高菌種對熒蒽的降解效率；對于吸附固定化菌-植物聯(lián)合修復河道底泥中熒蒽的污染，對底泥中熒蒽的降解率能達到86.14%，投加懸浮菌比菖蒲單獨降解底泥中熒蒽提高25.23%，而對懸浮菌進行吸附固定化又能在此基礎(chǔ)上提高5.56%.

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