甲胺鳶尾素對異丙腎上腺素致大鼠心肌損傷后相關(guān)炎性因子的影響

梁延鴿，牟艷玲

(1.濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南250200；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，山東省罕少見病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250062)

葛花，中藥名，具有解酒醒脾，止血保肝之功效，常用于傷酒煩熱口渴，頭痛頭暈，脘腹脹滿，吐血，腸風(fēng)下血等。葛花的主要成分包含葛花苷、尼泊爾鳶尾異黃酮、鳶尾苷等異黃酮[1]。研究指出，葛花苷等成分在體內(nèi)發(fā)揮生物活性的主要原因是因?yàn)槠淇纱x生成尼泊爾鳶尾異黃酮[2,3]。甲胺鳶尾素是葛花苷的代謝形成的新化合物，分子量為357，研究指出，甲胺鳶尾素可有效改善冠狀動(dòng)脈結(jié)扎引發(fā)的心肌缺血現(xiàn)狀，明顯提高心肌細(xì)胞的存活率[4,5]。本文通過構(gòu)建異丙腎上腺素致大鼠心肌缺血損傷模型，探究甲胺鳶尾素對損傷模型大鼠相關(guān)炎癥因子的影響情況。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及藥物

12月齡雄性Wistar大鼠，體重250-320 g，由濟(jì)南大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證號：SYXK(魯)20090014。甲胺鳶尾素：淡黃色粉末，純度大于99%，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥物合成室提供，生產(chǎn)批號：20080901。

1.2 試劑

TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB ELISA試劑盒，上海紀(jì)寧生物科技有限公司提供，生產(chǎn)批號分別為：20170109,2017021，20170510,20170408。Bcl-2、NF-κB相關(guān)抗體均產(chǎn)美國CST公司，SABC工作液試劑盒為上海瑞齊生物科技有限公司，蘇木精、二甲苯、無水乙醇均由濟(jì)南大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 儀器

超低溫冰箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)，全自動(dòng)生化分析儀(日立)，熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)，組織切片機(jī)(德國萊卡)，LEICA-QWIN圖像分析系統(tǒng)(德國萊卡)。

1.4 方法

選取雄性Wistar大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一段時(shí)間后，隨機(jī)分成4組(實(shí)驗(yàn)1組，實(shí)驗(yàn)2組，空白組及模型組)，每組15只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始灌胃。實(shí)驗(yàn)1組給予甲胺鳶尾素大劑量20 mg/(ml·100 g)灌胃、實(shí)驗(yàn)2組甲胺鳶尾素小劑量10 mg/(ml·100 g)灌胃、模型組和空白組給予1.0 ml/100 g生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥10 d后，并于1 h，各組(空白組除外)均皮下多點(diǎn)注射鹽酸異丙腎上腺素0.4m g/100 g，給藥的體積為0.8 ml/100 g，制備異丙腎上腺素致大鼠心肌損傷模型。

1.4.1血清TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB的測定

造模成功5 h后，每組大鼠從頸靜脈竇取靜脈血2 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存，根據(jù)放免試劑盒的說明測定TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB含量變化。

1.4.2Bcl-2、NF-κB蛋白免疫組化測定

頸靜脈取血后，迅速處死動(dòng)物，取新鮮心臟，在心尖部位病變處沿冠狀面取，放入10%的福爾馬林中固定，行Bcl-2、NF-κB蛋白免疫組化研究，操作方法按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 甲胺鳶尾素對異丙腎上腺素?fù)p傷大鼠模型血清TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB的影響

造模后取相應(yīng)材質(zhì)檢測，各組分別與空白組對比，其中實(shí)驗(yàn)1、2組及模型組血清TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB明顯升高(P<0.05)。與模型組對比，實(shí)驗(yàn)1、2組血清TNF-α、IL-1β、NF-κB分別明顯降低(P<0.05)，其中實(shí)驗(yàn)1組比實(shí)驗(yàn)2組降低的更加明顯(P<0.01)。與模型組對比，實(shí)驗(yàn)1、2組血清Bcl-2明顯升高(P<0.05)，其中實(shí)驗(yàn)1組比實(shí)驗(yàn)2組升高更加明顯(P<0.01)。(見表1)。

表1 甲胺鳶尾素對異丙腎上腺素?fù)p傷大鼠炎癥因子的影響

注：與空白組對比，*P<0.05；與模型組對比，#P<0.05；與實(shí)驗(yàn)2組對比，▲P<0.01。

2.2 甲胺鳶尾素對異丙腎上腺素?fù)p傷大鼠Bcl-2蛋白的影響

將各組大鼠進(jìn)行皮下注射異丙腎上腺素后，與空白組比較，其中模型組大鼠心肌組織中的Bcl-2蛋白升高(P<0.05)，甲胺鳶尾素灌胃的實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白明顯升高(P<0.01)。(見圖1)

2.3 甲胺鳶尾素對異丙腎上腺素?fù)p傷大鼠NF-κB蛋白的影響

將各組大鼠進(jìn)行皮下注射異丙腎上腺素后，與空白組比較，其中模型組、實(shí)驗(yàn)1、2組大鼠心肌組織中的NF-κB蛋白升高(P<0.05)，與模型組比較，實(shí)驗(yàn)1、2組血清NF-κB蛋白降低(P<0.05)，且實(shí)驗(yàn)1組較實(shí)驗(yàn)2組降低的更加明顯(P<0.01)。(見圖2)

注：*P<0.05，**P<0.01。 A：空白組，B：模型組，C：實(shí)驗(yàn)2組，D：實(shí)驗(yàn)1組

圖1大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白水平

注：*P<0.05，**P<0.01。A：空白組，B：模型組，C：實(shí)驗(yàn)2組，D：實(shí)驗(yàn)1組

圖2大鼠心肌組織中NF-κB蛋白水平

3 討論

異丙腎上腺素，是一種β受體激動(dòng)劑，臨床上常用于支氣管哮喘及心臟房室傳導(dǎo)阻滯。其藥理作用是興奮心臟β1受體，加快心率，擴(kuò)張冠脈，增加冠脈流量，過量時(shí)可引起心律失常和心肌缺血壞死。采用皮下注射異丙腎上腺素，能夠使大鼠的冠脈發(fā)生痙攣性收縮，從而提高心肌耗氧量，進(jìn)而誘發(fā)心肌缺血、缺氧、心功能紊亂狀態(tài)，即缺血再灌注損傷[6]。心肌組織發(fā)生缺血再灌注的損傷機(jī)制與炎癥因子的釋放存在密切關(guān)系。研究指出，炎癥因子例如TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB等，在心肌的缺血再灌注中起到了重要的作用[7-9]。炎癥因子引發(fā)的炎性反應(yīng)是導(dǎo)致動(dòng)脈出現(xiàn)粥樣硬化的主要原因，目前臨床上治療冠心病，抗炎干預(yù)也是新的研究方向。

心肌細(xì)胞的凋亡通路主要為死亡受體通路，死亡受體通路是重要的外源性凋亡通路，目前已知的死亡受體包括：IL-1β、TNF-α、DR3等[10]。TNF-α和IL-1β與受體結(jié)合后，可激活caspase-8蛋白并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11,12]。DR3等在相關(guān)受體的結(jié)合下，可活化NF-κB誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13,14]。Bcl-2蛋白家族以及NF-κB家族在心肌缺血再灌注損傷中有重要作用，其中Bcl-2蛋白水平表達(dá)越高，其抑制細(xì)胞凋亡的作用更加顯著[15,16]。Bcl-2的過度表達(dá)可以阻斷線粒體傳導(dǎo)通路，起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[17,18]。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)NF-κB蛋白的表達(dá)可以有效減少心肌細(xì)胞凋亡情況，有效防止心肌發(fā)生缺血再灌注損傷[19]。這說明IL-1β、TNF-α、NF-κ及Bcl-2等因子在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用。

本研究酶聯(lián)免疫結(jié)果顯示：造模后，實(shí)驗(yàn)組、模型組與空白組對比，TNF-α、IL-1β、NF-κB均出現(xiàn)升高現(xiàn)象，這與異丙腎上腺素對心肌細(xì)胞的刺激作用有關(guān)，但是實(shí)驗(yàn)組與模型組相比，TNF-α、IL-1β、NF-κB反而降低(P<0.05)，而且甲胺鳶尾素大劑量組降低效果要比小劑量組更顯著(P<0.01)，這說明甲胺鳶尾素能夠抑制炎性因子的釋放，有效的降低了TNF-α、IL-1β、NF-κB含量。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組、模型組與空白組相比，Bcl-2含量明顯增加(P<0.05)，說明缺血再灌注造成的心肌損傷誘使心肌細(xì)胞分泌Bcl-2增多；但是實(shí)驗(yàn)組與模型組對比，Bcl-2含量升高更為明顯，說明甲胺鳶尾素能夠促使心肌細(xì)胞分泌Bcl-2參與炎性反應(yīng)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，其中應(yīng)用大劑量的甲胺鳶尾素作用效果更加明顯(P<0.01)，說明了甲胺鳶尾素對心肌損傷有一定的保護(hù)作用。免疫組化結(jié)果顯示，在4個(gè)組中，Bcl-2以及NF-κB蛋白的表達(dá)結(jié)果與ELISA結(jié)果一致，說明甲胺鳶尾素可以有效調(diào)節(jié)Bcl-2及NF-κB蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2基因，抑制NF-κB蛋白釋放，減輕炎癥反應(yīng)，對心肌缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。

綜上所述，甲胺鳶尾素可以有效減少異丙腎上腺素導(dǎo)致的心肌缺血再灌注損傷，重新調(diào)節(jié)心臟穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)微血管擴(kuò)張，改善心肌細(xì)胞缺血情況，其調(diào)劑機(jī)制可能與調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放來減輕炎癥反應(yīng)，如抑制TNF-α、IL-1β因子的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白，抑制NF-κB蛋白等有關(guān)。后續(xù)研究我們將從基因方面展開，詳細(xì)探究甲胺鳶尾素對缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的干擾作用。

作者簡介：梁延鴿(1988-),女，在職研究生，藥師，研究方向：心腦血管藥理學(xué)。

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