熒光定量PCR染料法在HLA-B27檢測中的應用

富顯果,唐寶佳,楊 菁,曹羅元,葉作東,黃寶英*

(1.福建醫(yī)科大學附屬寧德市醫(yī)院 中心實驗室；2.福建醫(yī)科大學附屬寧德市醫(yī)院 血液風濕科；3.福建醫(yī)科大學附屬寧德市醫(yī)院 檢驗科,福建 寧德352100)

人類白細胞抗原B27是6號染色體短臂上的主要組織相容性復合體基因B位點上的第27等位基因的表達產(chǎn)物。既往研究表明 HLA-B27與強直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis,AS)之間存在高度的相關性,AS患者中HLA-B27陽性率高達96%以上,而在健康人群中則少于10%[1,2]。AS 是一種常見的侵犯脊柱和骶髂關節(jié)的慢性炎癥性疾病,具有高度的遺傳性,其發(fā)病機制尚不明確,至今尚無有效的根治方法。但AS患者如能得及時診斷及合理治療,可以控制癥狀并改善預后。目前AS診斷采用1984年修訂的紐約標準[3],主要依靠臨床表現(xiàn)及腰骶部影像學檢查,但AS患者早期臨床表現(xiàn)缺乏特異性,當關節(jié)出現(xiàn)影像學變化時,病程已非早期,難以很好地指導早期診斷和治療。因此HLA-B27的檢測結(jié)合AS患者的臨床表現(xiàn)及影像學檢查,可實現(xiàn)AS的早期診斷和治療。

HLA-B27的檢測方法主要有兩大類：一類是以流式細胞分析法(FCM)為主的抗原檢測法,另一類是PCR-SSP法為主的基因檢測法,兩類方法各有優(yōu)缺點[4]。目前各大醫(yī)院多采用流式細胞分析的抗原檢測法,但該法由于HLA-B27單克隆抗體與其它B族抗原(主要是B7和B40)存在不同程度交叉反應,可能出現(xiàn)一定的假陽性結(jié)果[5]。而常規(guī)PCR-SSP法采用等位基因特異性引物PCR擴增HLA-B27基因片段,然后進行凝膠電泳分析,可以準確地檢測HLA-B27陽性樣本,但該法仍需要進行電泳等PCR后續(xù)操作,這既增加了檢測時間,也增加了PCR產(chǎn)物交叉污染的可能性。2000年Bon等[6]采用熒光定量PCR法對HLA-B27進行基因分型,該方法在常規(guī)PCR-SSP法的基礎上,能夠?qū)CR每一循環(huán)的熒光強度進行實時檢測,無需PCR后續(xù)電泳操作,具有簡單、準確,快速、檢測通量高等優(yōu)點,并能夠?qū)崿F(xiàn)HLA-B27亞型分析。本文應用熒光定PCR染料法和流式細胞術分析對HLA-B27基因進行篩查,探討兩種方法在HLA-B27檢測中的應用價值。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源 收集從2015年4月-2016年12月間來我院就診的170例臨床疑似AS患者,男性113例,女性57例,年齡8-65歲,平均年齡37.1±13.6歲。所有患者抽取 EDTA抗凝外周血2 ml。

1.1.2主要試劑與儀器 Epics XL全自動流式細胞儀(美國Beckman公司)；StepOne Plus 熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；2720型PCR熱循環(huán)儀(美國ABI公司)；GenoSENS1500凝膠成像系統(tǒng)(上海勤翔科學儀器有限公司)；HLA-B27-FITC/B7-PE單克隆抗體及流式細胞分析相關配套試劑(美國Beckman公司 )；全血DNA提取試劑盒(美國Omega公司)；Taq酶及DNA分子量標準(大連Takara公司)；HLA-B27基因分型測定試劑盒(天津市秀鵬生物技術開發(fā)有限公司)。引物由上海生工生物工程有限公司合成,具體引物見表1。

1.2方法

1.2.1流式細胞術檢測HLA-B27 將50 μl全血加入測定管中,加入 10 μl免疫熒光標記的單克隆抗體HLA-B27 FITC/ HLA-B7 PE,混勻,室溫避光孵育20 min；加入250 μl Optilyse C溶血素,混勻,室溫避光 15 min；加入500 μl鞘液,混勻,3 000 r/min離心1 min,棄上清液,重復該步驟,最后加入500 μl鞘液重懸細胞,上機檢測。HLA-B27陽性判斷標準：HLA-B27 MFI>8.0,且HLA-B27+/HLA-B7-細胞百分比>80%。

1.2.2熒光定量PCR染料法檢測HLA-B27表達及亞型 (1)基因組DNA提取：使用OMEGA公司血液DNA提取試劑盒提取基因組DNA,具體步驟嚴格按試劑盒說明書進行。(2)HLA-B27表達及亞型檢測：具體實驗步驟參照HLA-B27基因分型檢測試劑盒說明書,基因擴增程序如下：96℃ 2 min,1個循環(huán)；96℃ 20sec,68℃ 60sec,5個循環(huán)；96℃ 20sec,65℃ 60sec,72℃ 40sec,10個循環(huán)；96℃ 20sec,63℃ 50sec,72℃ 45sec,15個循環(huán)；72℃ 2 min,1個循環(huán)；隨后以0.5℃/sec,從55℃到95℃測量SYBR GreenⅠ熒光,從而進行熔點曲線分析。依據(jù)八對等位基因特異性引物擴增產(chǎn)物顯示的擴增曲線及熔解曲線來進行HLA-B27亞型分析,結(jié)果見圖1B。

1.2.3HLA-B27基因外顯子2、3測序分析 采用等位基因特異性引物擴增HLA-B27基因第2、3外顯子。在50 μl PCR反應體系中,基因組DNA100 ng,引物各20pmol、4種dNTP各0.2 mmoL/L,2.5U rTaq酶。96℃預變性2 min后,按下列參數(shù)：94℃ 30 s,63℃ 1 min,72℃ 1 min,共30個循環(huán),最后一個循環(huán)72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收并送上海生工生物工程有限公司進行測序。HLA-B27基因外顯子2、3擴增引物及測序引物參照文獻[7],見表1。

A：PCR-SSP法擴增HLA-B27基因電泳圖 以B*2704為例,泳道3、5、7有特征性擴增產(chǎn)物,泳道8為內(nèi)參；M：DNA分子量標準(從上至下為：2 000,1 000,750,500,250,100 bp)。B:熒光定量PCR染料法檢測HLA-B27亞型特征性熔解曲線圖 四條特征性熔解曲線峰從左到右分別對應圖2A中3,5,7,8泳道擴增產(chǎn)物,提示為B*2704亞型。

圖1熒光定量PCR染料法檢測HLA-B27表達及亞型

表1 HLA-B27 外顯子2和3擴增和測序引物

1.2.4統(tǒng)計學分析 應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行χ2 檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1流式細胞術與熒光定量PCR染料法檢測HLA-B27結(jié)果比較對170例臨床疑似AS患者,采用流式細胞分析HLA-B27-FITC/B7-PE雙熒光染色法篩查HLA-B27基因,檢測出陽性163例；采用熒光定量PCR染料法,檢測出陽性158例,其中B*2704 153例(96.8%),B*2705 3例(1.9%),B*2706 2例(1.3%)；兩者之間有5例結(jié)果不一致,結(jié)果見表2。兩種方法的符合率為92.9%,經(jīng)配對χ2檢驗,兩種方法檢測差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 流式細胞術與熒光定量PCR染料法檢測HLA-B27結(jié)果比較

2.2兩種檢測方法不一致結(jié)果分析5例不一致樣本,均為流式細胞術檢測陽性,而熒光定量PCR染料法為陰性,并提示可能為HLA-B*18、B*40及B*47的亞型。對這5例不一致樣本,進一步應用等位基因特異性引物擴增HLA-B27基因第2、3外顯子并進行測序分析,結(jié)果顯示,3例為B*4001與B*5801雜合型,1例為B*4002與B*5801雜合型,1例為B*4001純合型,見表3。

表3 兩種方法檢測不一致結(jié)果比較

3 討論

目前,流式細胞分析檢測HLA-B27抗原的方法在各大醫(yī)院中應用,該方法采用熒光素標記的單克隆抗體檢測淋巴細胞表面的HLA-B27抗原,具有分析簡便、速度快、靈敏等優(yōu)點,但也存在一些缺點：(1)檢測標本需新鮮采集,無法長期保存；(2)HLA-B27單克隆抗體與其它B族抗原B7、B40等交叉反應抗原大家族(CREG)存在不同程度交叉反應,可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果[5]。雖然本研究采用HLA-B27/ HLA-B7雙標記熒光探針檢測HLA-B27抗原表達,有效地避免了HLA-B7造成的假陽性結(jié)果,但仍無法排除由其它交叉反應抗原家族(CREG)成員的交叉反應。本研究中5例樣本為流式細胞分析為陽性結(jié)果,而熒光定量PCR法為陰性,經(jīng)測序分析顯示為B*40亞型或B*40與B*58的雜合型。

熒光定量PCR染料法基于聚合酶鏈式反應-序列特異性引物法(PCR-SSP)反應原理,引物3'末端的第一個堿基與HLA-B27等位基因特異性堿基互補,特異性引物對僅擴增與其相匹配的HLA-B27等位基因,具有較高的靈敏度和特異性,且無需后續(xù)電泳分析,既能節(jié)省檢測時間,也能有效地避免遺留污染的發(fā)生。國內(nèi)多家醫(yī)院已將該方法用于HLA-B27基因的檢測,與流式細胞分析方法相比,具有較高的符合率[8-10]。本研究結(jié)果也顯示,兩者的檢測符合率為92.9%,與國內(nèi)的報道相一致,同時熒光定量PCR染料法也確認了5例流式細胞假陽性結(jié)果,從而提高了HLA-B27檢測的準確性。

HLA-B27 基因與AS 之間存在非常強的關聯(lián)性,AS患者中HLA-B27陽性率高達96%以上,而在健康人群中則少于10%[1,2]。目前,依據(jù)IMGA/HLA Database Release HLA-B27等位基因數(shù)據(jù)庫,B27多態(tài)性已達到156種之多,針對B27 基因多態(tài)性與AS 的相關性也進行了大量的研究顯示,不同地區(qū)、民族和人種之間HLA-B27 亞型與AS的關聯(lián)是有區(qū)別的,其中,白種人與B2702和B2705相關,其中B2705亞型占絕大多數(shù)；而在中國漢族人群中,B2704和B2705構(gòu)成了B27的優(yōu)勢亞型,另外還檢出少數(shù)的B2702、B2703、B2707、B2708、B2711、B2713、B2715和B2722等亞型[11,12]。同時,不同地區(qū)漢族人群的AS患者分布以及在誘發(fā)AS 的發(fā)病風險方面也是存在地域差異,B*2704 與AS 的相關性要強于B* 2705[12]；而也有學者指出北方漢族與上海、廣東、臺灣地區(qū)AS 患者中B27 基因多態(tài)性的分布有較大差異,其中B*2705差異最顯著[13]。本研究采用多對等位基因特異性引物的熒光定量PCR染料法對158例AS相關HLA-B27陽性患者進行亞型分析,結(jié)果顯示：B*2704為主要亞型,占96.8%,其次為B*2705,占1.9%,另有2例為B*2706,占1.3%,這說明B*2704在AS的發(fā)病中起主導作用,這與該結(jié)果與國內(nèi)漢族其他地區(qū)的研究基本一致[14-16]。因此,采用該熒光定量PCR染料法,可克服流式細胞分析無法鑒定亞型的缺點,可為AS的診斷和治療提供更為可靠的輔助診斷依據(jù),并為深入探討HLA-B27在AS發(fā)病中的作用提供依據(jù)。

綜上所述,熒光定量PCR染料法可有效提高HLA-B27檢測的準確性,并能夠?qū)崿F(xiàn)HLA-B27亞型分析,從而可為AS的早期診斷和治療提供可靠的輔助診斷依據(jù)。

作者簡介：富顯果(1979-),男,副主任技師,醫(yī)學博士,主要從事免疫和分子生物學檢驗及研究。

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