青蒿琥酯及其制劑中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法探討*

趙 畫 ，曾令高

（1.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121； 2.上海市食品藥品包裝材料測(cè)試所，上海 201203）

青蒿素是從中藥青蒿中提取的有過(guò)氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯類化合物，具有抗瘧疾作用，由我國(guó)在20世紀(jì)70年代獨(dú)立研制，并于1986年獲批為國(guó)家一類新藥。由于其生物利用度低，后續(xù)研發(fā)出雙氫青蒿素、青蒿琥酯等半倍萜內(nèi)酯化合物青蒿素的衍生物，均作為一類新藥獲準(zhǔn)上市[1]。青蒿琥酯作為其衍生物之一，具有更好的生物利用度，臨床用于瘧疾、寄生蟲病甚至腫瘤、病毒等的治療[2－9]。其合成工藝大多以青蒿素為起始原料，合成過(guò)程中易引入起始原料青蒿素、中間體雙氫青蒿素及降解產(chǎn)物等潛在雜質(zhì)，在合成及儲(chǔ)存過(guò)程中受熱易分解產(chǎn)生雙氫青蒿素、脫水雙氫青蒿素等降解產(chǎn)物。因此，對(duì)青蒿琥酯及其制劑的工藝雜質(zhì)及降解產(chǎn)物進(jìn)行研究和控制十分有必要。目前，2016年版《國(guó)際藥典》和2015年版《中國(guó)藥典（二部）》[10]收錄了青蒿琥酯及其制劑中有關(guān)物質(zhì)的檢查方法，但雜質(zhì)I的獲取和結(jié)構(gòu)表征未見報(bào)道。本研究中對(duì)已收載的檢測(cè)方法進(jìn)行了比較及優(yōu)化，最終確定了適合青蒿琥酯及其片劑和注射用制劑的檢測(cè)方法，并對(duì)難以獲得對(duì)照品的雜質(zhì)I（脫水雙氫青蒿素）提供了定性獲取方法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀；XS205型電子天平(梅特勒公司，感量為 0.01 mg/0.1 mg)；CP224 型電子天平(賽多利斯公司)；FD240型烤箱(德國(guó)賓德公司)。

1.2 試藥

青蒿琥酯（市售品）；青蒿琥酯片（市售品，規(guī)格為每片50 mg或100 mg）；注射用青蒿琥酯（市售品，規(guī)格為每瓶60 mg）；青蒿琥酯對(duì)照品（批號(hào)為100200－201003），雙氫青蒿素對(duì)照品（批號(hào)為 100184－200401），青蒿素對(duì)照品（批號(hào)為100202－201004），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；脫水雙氫青蒿素對(duì)照品（上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司，含量為83.73%）；乙腈為色譜純；試驗(yàn)用水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜條件：色譜柱為DikmaDiamonsilC18柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液（pH ＝ 3.0） － 乙腈（56∶44）；流速為 1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為 216nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20 μL。青蒿琥酯無(wú)共軛吸收，參考《國(guó)際藥典》標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)波長(zhǎng)選用216nm。采用外標(biāo)法測(cè)定。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取經(jīng)100℃熱破壞30 min的青蒿琥酯原料干粉0.101 90 g，青蒿素對(duì)照品0.010 71 g，雙氫青蒿素對(duì)照品0.012 11 g，置100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，即得系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液，取20 μL進(jìn)樣，色譜圖見圖 1。雙氫青蒿素（峰2）和青蒿琥酯（峰3）分離度為2.97，各雜質(zhì)峰相對(duì)于青蒿琥酯的保留時(shí)間，雙氫青蒿素為 0.57和 0.91，青蒿素為 1.31，雜質(zhì) I為 2.74。

圖1 青蒿琥酯系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖

2.2 溶液制備

供試品溶液：取青蒿琥酯或注射用青蒿琥酯粉末40 mg，分別置10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為青蒿琥酯相應(yīng)供試品溶液；取青蒿琥酯片，研為細(xì)粉，取適量（約相當(dāng)于青蒿琥酯 40 mg），置10 mL容量瓶中，加乙腈適量，振搖或超聲15 min使溶解，冷卻，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，用 0.45 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為青蒿琥酯片供試品溶液。

對(duì)照溶液：精密量取青蒿琥酯、注射用青蒿琥酯和青蒿琥酯片供試品溶液各1 mL，分別置100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，分別作為其對(duì)照溶液。

2.3 測(cè)定方法

精密量取供試品溶液和對(duì)照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的4倍。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：1）酸破壞，取青蒿琥酯約100 mg，置25 mL容量瓶中，加1 mol/L鹽酸溶液 5 mL，水浴加熱5 min，取出放冷，用氫氧化鈉溶液調(diào)至中性，加乙腈至刻度，濾過(guò)；2）堿破壞，取青蒿琥酯約100 mg，置25 mL容量瓶中，加 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液 5 mL，振搖5 min，用鹽酸溶液調(diào)至中性，加乙腈至刻度，濾過(guò)；3）氧化破壞，取青蒿琥酯約40 mg，置10 mL容量瓶中，加30%H2O2溶液2 mL，水浴加熱10 min，取出放冷，加乙腈至刻度，濾過(guò)；4）光破壞，取青蒿琥酯，在4 500 lx光強(qiáng)度照射下，7 d后取樣 40 mg，加乙腈 10 mL溶解；5)高溫破壞，取青蒿琥酯置平皿中，敞口放于100℃培養(yǎng)箱中，6 h后，取樣40 mg，加乙腈10 mL溶解。按上述有關(guān)物質(zhì)檢查法各進(jìn)樣20 μL測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，上述高效液相色譜（HPLC）法能使按強(qiáng)制破壞方法獲取的各雜質(zhì)與青蒿琥酯有效分離，專屬性強(qiáng)。

耐用性試驗(yàn)：照2.1項(xiàng)下色譜條件和方法配制系統(tǒng)適用性溶液，分別考察了在不同品牌填料的色譜柱中青蒿琥酯峰與10－異構(gòu)－雙氫青蒿素峰的分離情況。結(jié)果各型號(hào)色譜柱均能達(dá)到分離要求，表明該色譜系統(tǒng)適用于目前市場(chǎng)上的絕大多數(shù)C18色譜柱。

相對(duì)響應(yīng)因子考察：稱取青蒿琥酯、雙氫青蒿素、青蒿素和雜質(zhì) I（含量 83.73% ）對(duì)照品 0.010 18，0.010 09，0.010 42，0.010 14 g，置同一 10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度。按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各峰與青蒿琥酯峰的響應(yīng)因子。因考慮到雙氫青蒿素在乙腈中溶解度不好，故未考察4 mg/mL的質(zhì)量濃度響應(yīng)因子。結(jié)果見表1。

表1 相對(duì)響應(yīng)因子考察結(jié)果

定量限及檢測(cè)限測(cè)定：取相對(duì)響應(yīng)因子考察項(xiàng)下溶液5.0 mL，置100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得雙氫青蒿素、青蒿素和雜質(zhì)I質(zhì)量濃度分別為0.050 45，0.052 10，0.050 70 mg/mL 的溶液，量取 5 μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖。以信噪比（S/N）為3或10計(jì)算檢測(cè)限及定量限，雙氫青蒿素為 0.105 4 μg 和 0.351 3 μg，10 － 異構(gòu) － 雙氫青蒿素為 0.299 1 μg 和 0.997 0 μg，青蒿素為0.182 6 μg 和 0.608 6 μg， 雜 質(zhì) I 為 0.031 4 μg 和0.104 8 μg。

2.5 雜質(zhì) I結(jié)構(gòu)確認(rèn)

在熱破壞中發(fā)現(xiàn)，相對(duì)保留時(shí)間2.7處有1個(gè)較大雜質(zhì)，2016年版《國(guó)際藥典》中提出其為雜質(zhì)C（脫水雙氫青蒿素），2015年版《中國(guó)藥典》命名為雜質(zhì)I。為確保熱破壞產(chǎn)生的雜質(zhì)即為雜質(zhì)I，對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確認(rèn)。

定性獲?。翰捎肳aters2695型高效液相色譜儀試驗(yàn)。色譜條件為 Phenomenex Luna C18（2）色譜柱（100 mm ×4.6 mm，3 μm），流速 1.0 mL/min，流動(dòng)相為磷酸緩沖液（pH ＝3.0）－乙腈（56∶44）。為確保熱破壞獲得的雜質(zhì) I滿足檢測(cè)限要求，首先采用極限破壞試驗(yàn)，取100℃加熱破壞31 h的原料干粉0.01 g，置25 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，得供試品熱破壞溶液。在長(zhǎng)時(shí)間熱破壞條件下，青蒿琥酯峰絕大多數(shù)降解為雜質(zhì)I。

保留時(shí)間確認(rèn)：取雜質(zhì)I對(duì)照品適量，用乙腈配置成質(zhì)量濃度為1 g/L的溶液，取此溶液和供試品熱破壞溶液各20 μL，進(jìn)樣，色譜圖見圖2。結(jié)果保留時(shí)間一致。

圖2 雜質(zhì)I確認(rèn)高效液相色譜圖

二級(jí)質(zhì)譜確認(rèn)：取雜質(zhì)I對(duì)照品和供試品熱破壞溶液進(jìn)行分子量確認(rèn)。儀器為Waters TQD－UPLC型超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀。質(zhì)譜條件為，電噴霧正離子化，噴霧電壓3 kV，錐孔電壓35 V；二級(jí)質(zhì)譜掃描子離子模式，碰撞能量8 eV。色譜條件為，AIQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm），流速為 0.5 mL/min，流動(dòng)相為乙腈－水（44∶56）。通過(guò)對(duì)2種溶液中雜質(zhì) I的一級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其質(zhì)譜裂解行為一致。

相對(duì)分子質(zhì)量確認(rèn)：對(duì)供試品熱破壞溶液中雜質(zhì)I的分子量進(jìn)行確認(rèn)。儀器為Waters四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜－超高效液相色譜儀。質(zhì)譜條件為，電噴霧正離子化，噴霧電壓 3 kV，錐孔電壓 35 V。色譜條件為AIQUITYUPLCBEHC18色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm），流速為 0.5 mL/min，流動(dòng)相為乙腈 － 水（44 ∶56）。結(jié)果推測(cè)出來(lái)的相對(duì)分子質(zhì)量為267.157 8，提供的結(jié)構(gòu)式僅為I15H23O4，這與2011年版《國(guó)際藥典》提供的雜質(zhì)I（脫水雙氫青蒿素）的分子式和相對(duì)分子質(zhì)量一致，確認(rèn)熱破壞的雜質(zhì)峰即為雜質(zhì)I。

2.6 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

取青蒿琥酯、青蒿琥酯片和注射用青蒿琥酯供試品，照2.1項(xiàng)下系統(tǒng)適用性試驗(yàn)方法處理，結(jié)果有不同程度的雜質(zhì)檢出。結(jié)果見表2。

3 討論

對(duì)青蒿琥酯進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗(yàn)，并對(duì)其降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯對(duì)強(qiáng)光條件穩(wěn)定。在高溫條件下，容易降解產(chǎn)生雜質(zhì)脫水雙氫青蒿素；在強(qiáng)氧化，強(qiáng)酸和強(qiáng)堿條件下均不穩(wěn)定，產(chǎn)生雙氫青蒿素及其他未知雜質(zhì)，通過(guò)對(duì)已知雜質(zhì)對(duì)照品的液相保留時(shí)間確認(rèn)確定了雙氫青蒿素、青蒿素的出峰順序和與青蒿琥酯的相對(duì)保留時(shí)間。

由于市售脫水雙氫青蒿素對(duì)照品難以購(gòu)買，《中國(guó)藥典》采用相對(duì)保留時(shí)間對(duì)雜質(zhì)I進(jìn)行定位。但在實(shí)際檢驗(yàn)中，以相對(duì)保留時(shí)間定位雜質(zhì)可能會(huì)出現(xiàn)混淆，難以對(duì)特定雜質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位。為更準(zhǔn)確定位雜質(zhì)I，采用熱破壞后，與對(duì)照品保留時(shí)間和二級(jí)質(zhì)譜的方法同時(shí)對(duì)其進(jìn)行確認(rèn)，并經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熱破壞30 min即可產(chǎn)生雜質(zhì)I，在不采用雜質(zhì)對(duì)照品的同時(shí)準(zhǔn)確定位雜質(zhì)I，便于檢測(cè)過(guò)程中進(jìn)行定性控制。

表2 青蒿琥酯原料及其制劑有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果（%）

通過(guò)雜質(zhì)對(duì)照品和二級(jí)質(zhì)譜的方式對(duì)已知雜質(zhì)進(jìn)行了確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)其相較主要成分保留穩(wěn)定，并對(duì)其檢測(cè)限和定量限進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果表明，該方法可以準(zhǔn)確地分析樣品中的已知和未知雜質(zhì)。

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