利拉魯肽早期干預(yù)對高脂飲食大鼠代謝的影響

王良雪 李春盈 洪瑩 鄭超

隨著西方高熱量生活方式的傳播，近幾十年來肥胖的患病率急劇增加，是一個非常普遍的全球公共健康問題。目前，改變生活方式和運動干預(yù)被視為肥胖的預(yù)防和治療的基石，但許多患者很難改變生活方式；減肥手術(shù)雖然有效，但有手術(shù)相關(guān)風(fēng)險和體重反彈的可能性，許多減肥藥物因為嚴重的不良反應(yīng)已經(jīng)退出市場。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）是一種腸道內(nèi)分泌L細胞分泌的促胰島素分泌的激素，葡萄糖依賴性促進胰腺β細胞分泌胰島素，減慢胃排空和控制食物攝入量，除了對食欲的影響外，GLP-1還可能在能量代謝中起作用。然而，在生理條件下，內(nèi)源性GLP-1的活性很快被二肽基肽酶IV（DPP-4）降解[1]。利拉魯肽是一種GLP-1受體激動劑，2014年9月，美國食品藥物管理局（FDA）批準利拉魯肽3mg用于治療肥胖，在此之前，低劑量利拉魯肽1.8mg已被廣泛用于治療2型糖尿病，且已經(jīng)證明利拉魯肽治療非糖尿病肥胖患者具有減肥和改善心血管的作用[2]。筆者通過建立高脂喂養(yǎng)大鼠模型，旨在觀察利拉魯肽早期干預(yù)對高脂喂養(yǎng)大鼠代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 60%脂肪的高脂飼料購自江蘇美迪森股份有限公司；利拉魯肽購自丹麥諾和諾德公司；大鼠血清TG、TC、GLP-1的ELISA試劑盒購自上海博蘊生物科技有限公司；麻醉藥戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司；GLP-1受體一抗購自英國Biorbyt公司，CD34一抗購自英國Abcam公司。

1.2 動物 SPF級6周齡雄性SD大鼠18只,體重（160±10）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。實驗動物合格證編號為XI504106，實驗動物獲得倫理委員會批準。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為正常飲食（ND組）、高脂飲食（HFD組）、高脂飲食的同時利拉魯肽干預(yù)（Lira組），每組6只，利拉魯肽皮下注射200μg/kg，1次/d，高脂組皮下注射等量0.9%氯化鈉注射液。每周記錄進食量、體重、每2周測定血糖，16周行葡萄糖耐量實驗。18周末行胰島素鉗夾實驗，胰島素鉗夾實驗結(jié)束后頸動脈取血、心臟灌流法處死、取組織。

1.3 方法

1.3.1 總攝食量 1～13周每天記錄每組每只大鼠進食量，直至實驗結(jié)束計算得到每只大鼠總進食量；食物利用率（%）=每只大鼠總體重增長量/每只大鼠總攝食量×100%；脂體比（%）=睪丸與腎周內(nèi)臟脂肪濕重/總體重×100%。

1.3.2 血清生物化學(xué)測定 采用酶聯(lián)免疫法測定血清TG、TC、GLP-1水平。

1.3.3 肝組織及骨骼肌組織染色 觀察每只大鼠取相同部位新鮮肝組織和骨骼肌組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色后鏡下觀察肝臟脂肪變程度；石蠟切片經(jīng)脫蠟、脫水、高壓抗原修復(fù)、5%BSA室溫封閉1h，肝組織GLP-1受體一抗4℃孵育過夜，骨骼肌組織CD34一抗4℃孵育過夜，PBS洗3次，5min/次，熒光二抗37℃ 1h，DAPI染核10min，封片鏡下觀察肝細胞GLP-1受體免疫熒光染色，確定是否有GLP-1受體表達；CD34特異表達于血管內(nèi)皮細胞，染色結(jié)果骨骼肌橫切面綠色熒光代表一個血管，觀察骨骼肌組織毛細血管密度。

1.3.4 胰島素敏感性實驗 葡萄糖耐量實驗：大鼠饑餓12h，測0min空腹血糖，腹腔注射20%的葡萄糖，分別測定15、30、60和90min的血糖水平。胰島素鉗夾實驗：18周開始大鼠饑餓15h，腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉40mg/kg，麻醉平穩(wěn)20min后迅速完成氣管插管，頸外動靜脈置管,動脈通過裝有肝素生理鹽水30U/ml的微量注射泵連接血壓儀，監(jiān)測血流動力學(xué)；靜脈通過3通管連接2個微量注射泵，分別注射30%的葡萄糖和胰島素30mU/（kg·min），每10min測定1次頸動脈血糖，葡萄糖速率逐漸增加使血糖波動在基礎(chǔ)血糖±10%以內(nèi)，最后3次穩(wěn)態(tài)葡糖糖輸注率的均值作為胰島素鉗夾實驗的葡萄糖輸注率[GIR，mg/（kg·min）]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料用 表示，多組間采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者用Tukey檢驗，方差不齊者用Dunnett－t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠一般狀態(tài)、肝臟和內(nèi)臟脂肪情況 3組大鼠全部存活，ND組大鼠毛順、靈活好動、肝臟紅潤細膩、睪丸及腎周脂肪少；HFD組大鼠毛色黃有光澤、溫順不喜動、肝臟黃膩且切面呈顆粒狀、睪丸及腎周脂肪堆積；Lira組大鼠的一般情況與ND組相似。

2.2 3 組大鼠攝食量、食物利用率、體重、脂體比的比較由于正常飼料干爽，高脂飼料油膩濕潤，兩者質(zhì)量及性狀不一樣，兩種飼料之間攝食量與食物利用率的比較沒有意義。HFD組大鼠體重和脂體比分別增加了19%、89%，與ND組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；Lira組大鼠體重和脂體比與ND組均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）；HFD組大鼠攝食量與食物利用率顯著高于Lira組（P＜0.05），詳見表 1。

表1 3組大鼠攝食量、食物利用率、體重、脂體比的比較

2.3 大鼠血脂和血清GLP-1濃度的變化 與ND組相比，HFD組大鼠血清TG、TC顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與HFD組相比，Lira組大鼠血清TG、TC顯著下降，GLP-1濃度顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05），詳見表 2。

表2 3組大鼠血清學(xué)結(jié)果的比較

2.4 3 組大鼠葡萄糖耐量及胰島素鉗夾實驗結(jié)果的比較 與ND組相比，HFD組大鼠葡萄糖耐量實驗AUC顯著增高，胰島素鉗夾實驗GIR顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。Lira組大鼠葡萄糖耐量正常，GIR與ND組相比未發(fā)生顯著性變化，詳見圖1-2。

2.5 3 組大鼠肝組織切片觀察 ND組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞呈放射狀有序排列，未見脂肪空泡；HFD組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞雜亂無章，布滿脂肪空泡；Lira組大鼠與正常組類似，未發(fā)生明顯變化。肝組織存在GLP-1受體。詳見圖3-4（插頁）。

2.6 3 組大鼠骨骼肌血管染色觀察 與ND組相比，HFD組大鼠骨骼肌毛細血管密度（鏡下毛細血管數(shù)/肌纖維數(shù)）顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。利拉魯肽干預(yù)保留了骨骼肌的毛細血管密度。詳見圖5。

3 討論

人類每天皮下注射1.8mg的利拉魯肽，食物的攝入量與對照組相比平均減少18%[3]，與本研究一致，在1～13周，與高脂組相比，利拉魯肽組大鼠食物攝入平均減少約11.4%，最終高脂組與利拉魯肽組體重比較差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。利拉魯肽一方面延緩胃排空增加飽腹感，另一方面通過腸腦軸的攝食中樞減少食欲。腦干尾部的孤束核是調(diào)節(jié)能量平衡的關(guān)鍵核，孤束核作為循環(huán)神經(jīng)內(nèi)分泌因子的傳感器，是大腦中接收和處理胃腸道產(chǎn)生迷走神經(jīng)介導(dǎo)的飽食信號的第一站，最新研究表明，孤束核的星形膠質(zhì)細胞不僅結(jié)合、內(nèi)化GLP-1受體激動劑，并對其有相應(yīng)的信號反應(yīng)，孤束核星形膠質(zhì)細胞介導(dǎo)GLP-1受體信號的能量平衡[4]。

圖1 葡萄糖耐量實驗（a:腹腔注射葡萄糖耐量實驗動態(tài)過程；b:葡萄糖耐量實驗AUC，*P＜0.01）

圖2 胰島素鉗夾實驗（a:胰島素鉗夾實驗動態(tài)過程；b:胰島素鉗夾的葡萄糖輸注率GIR，*P＜0.01）

Lira組大鼠的食物利用率顯著低于比HFD組，除了對食欲的影響外，GLP-1還可能在能量代謝中起作用。已有研究證明人類空腹血漿GLP-1濃度越高，靜息能量消耗和脂肪氧化率越高，對嚙齒動物的研究表明,側(cè)腦室注射GLP-1可能增加能量消耗和改變?nèi)剂系睦寐?，有利于脂肪和碳水化合物的氧化。本研究結(jié)果顯示，Lira組大鼠食物利用率降低、血漿GLP-1水平顯著升高（P＜0.05），可能與利拉魯肽增加能量代謝率有關(guān)。在哺乳動物主要有兩種脂肪組織，白色脂肪組織（WAT）和棕色脂肪組織（BAT）。棕色脂肪組織通過線粒體呼吸鏈中的解偶聯(lián)蛋白1（UCP1）專門提供產(chǎn)熱，經(jīng)過多年的研究，第三種脂肪細胞既褐色脂肪已在嚙齒類動物和人類的白色脂肪組織中發(fā)現(xiàn)，類似于棕色脂肪細胞表達UCP1和其他產(chǎn)熱的基因消耗能量[5]。由于褐色脂肪組織產(chǎn)熱性，能越來越多的科學(xué)研究都集中于白色脂肪組織褐變，促進白色脂肪組織（WAT）獲得棕色脂肪組織的特點是減少肥胖的一種有效方法。已報道，在小鼠側(cè)腦室快速注射利拉魯肽活躍棕色脂肪組織產(chǎn)熱（BAT）和白色脂肪組織褐變，顯著減少白色脂肪細胞的大小[5]。

HFD組大鼠脂體比、血清TG、TC比ND組顯著增加；肝組織病理觀察脂肪肝明顯，Lira組大鼠脂體比、血清TG和TC顯著減少，脂肪未發(fā)生明顯病理變化。除了進食量和能量代謝，利拉魯肽可以改善血脂譜和肝臟參數(shù)，已經(jīng)證實，利拉魯肽在離體實驗中，減少人原代肝細胞脂肪酸的從頭合成，從而減少肝細胞脂肪變性[6]，且通過增加肝臟腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化（AMPK）促進脂肪酸氧化和抑制脂肪酸的合成[7-8]。本研究結(jié)果也證實肝組織的確存在GLP-1受體。

圖5 骨骼肌毛細血管密度（*P＜0.05，**P＜0.01）

解釋外周組織胰島素抵抗的潛在機制是理解2型糖尿病病因的基石之一，骨骼肌對胰島素的敏感性逐漸降低，被認為是疾病過程中的主要事件。胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取在骨骼肌占80%左右，從而肌肉葡萄糖攝取受損是胰島素抵抗的發(fā)病機制的重要因素[9]。有證據(jù)表明胰島素跨內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移到骨骼肌是胰島素刺激肌肉葡萄糖攝取的限速步驟。因此，減少肌肉血流量或毛細血管密度與胰島素抵抗有關(guān)。高脂大鼠微循環(huán)可能存在結(jié)構(gòu)或功能缺陷，導(dǎo)致肌肉毛細血管灌注減少。骨骼肌胰島素抵抗實際上是由于肌肉和脈管系統(tǒng)的缺陷，影響葡萄糖的輸送和提取。在本實驗中，利拉魯肽保留高脂喂養(yǎng)大鼠骨骼肌中毛細血管密度，改善胰島素抵抗，雖然Lira組大鼠的胰島素敏感性與控制體重有關(guān)，但是骨骼肌毛細血管的密度也起著一定的作用[10]。

總之，高脂飲食大鼠利拉魯肽早期干預(yù)可以顯著控制體重，改善脂質(zhì)代謝和脂肪肝的發(fā)生、發(fā)展，葡萄糖依賴性控制血糖且維持胰島素敏感性，隨著高熱量飲食生活方式的盛行，急劇增加的肥胖患病率給全球帶來了巨大的經(jīng)濟負擔(dān)，利拉魯肽對攝食、能量代謝、脂肪代謝、胰島素敏感性等多方面的影響，是臨床肥胖患者早期干預(yù)的一種潛在治療藥物。

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