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    維生素D受體基因啟動(dòng)子甲基化異常與嬰兒尿路感染相關(guān)性研究

    2018-06-28 09:13:32楊建環(huán)王德選陳敏廣胡小涵
    浙江醫(yī)學(xué) 2018年12期
    關(guān)鍵詞:亞硫酸氫鈉尿路感染甲基化

    楊建環(huán) 王德選 陳敏廣 胡小涵

    尿路感染是嬰幼兒時(shí)期最常見(jiàn)的發(fā)熱性疾病之一,約2%的男孩和8%的女孩在6歲內(nèi)曾患過(guò)急性尿路感染,反復(fù)的尿路感染可引起腎瘢痕形成、高血壓、腎功能不全等[1]。維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)是核受體超家族成員之一,在哺乳動(dòng)物中幾乎所有組織均表達(dá)VDR[2]。維生素D3/VDR信號(hào)涉及機(jī)體的礦物質(zhì)代謝和骨穩(wěn)態(tài),調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育,并在癌癥預(yù)防及調(diào)節(jié)免疫功能等方面發(fā)揮重要作用[3-4]。

    DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳修飾途徑之一,而DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)參與了DNA甲基化過(guò)程[5]。基因啟動(dòng)子區(qū)域和增強(qiáng)子區(qū)域CpG島的甲基化可以使一些轉(zhuǎn)錄因子無(wú)法與DNA相結(jié)合,從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄;而特定基因的低甲基化可導(dǎo)致該基因呈過(guò)度表達(dá)狀態(tài),從而參與疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程[6]。研究表明VDR基因啟動(dòng)子甲基化異??赡芘c某些疾病的發(fā)生相關(guān),如乳腺癌患者的VDR基因啟動(dòng)子甲基化異??赡芘c化療耐藥相關(guān)[7]。然而目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)VDR基因啟動(dòng)子甲基化異常與嬰兒尿路感染的相關(guān)性研究尚少,因此本研究旨在探討尿路感染嬰兒VDR基因表達(dá)變化,同時(shí)研究DNA甲基化異常對(duì)VDR基因表達(dá)的影響。

    1 對(duì)象和方法

    1.1 對(duì)象 選擇2015年8月至2016年2月在本院兒童腎內(nèi)科住院的急性尿路感染患兒32例(尿路感染組),年齡1~12個(gè)月。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)初發(fā)的發(fā)熱性尿路感染;(2)主要臨床癥狀為發(fā)熱、喂養(yǎng)困難、嘔吐、尿液渾濁、尿臭、排尿哭吵不安、精神萎靡等;(3)白細(xì)胞尿或膿尿;(4)腎靜態(tài)核素顯像提示腎盂腎炎。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并腎臟或泌尿道先天性畸形的嬰兒;(2)合并尿路結(jié)石。選擇同期本院門(mén)診健康體檢嬰兒30例作為健康對(duì)照組,年齡1~12個(gè)月。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患兒家屬知情同意。

    1.2 VDR、DNMTs mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。先用Trizol法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞的總mRNA,逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA(PrimeScript RT reagent Kit,大連寶生物工程有限公司)。再用SYBR Green熒光定量PCR法檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平[FastStart Universal SYBR Green Master(ROX),羅氏(Roche)生物公司],反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min,然后95℃變性 10s,60℃退火 20s、72℃延伸 20s,共 40 個(gè)循環(huán)。結(jié)果以 2-ΔCT相對(duì)定量表示,所有樣本均設(shè)置復(fù)孔。引物合成由上海生工生物有限公司完成,引物序列見(jiàn)表1。

    表1 PCR引物序列

    1.3 重亞硫酸氫鈉測(cè)序技術(shù)(BSP)檢測(cè)VDR基因啟動(dòng)子的甲基化水平 提取樣本的全血基因組DNA 1ng~2μg,血液基因組DNA提取試劑盒購(gòu)置天根生化科技(北京)有限公司,操作過(guò)程參考說(shuō)明書(shū)。經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后[EpiTect bisulfite kit試劑盒,凱杰生物技術(shù)(上海)有限公司,操作過(guò)程參考說(shuō)明書(shū)],DNA序列中非甲基化的脫氧胞嘧啶(C)均被亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跄蜞奏ぃ║),而甲基化狀態(tài)下脫氧胞嘧啶(C)不會(huì)被亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)變。將亞硫酸氫鈉處理后的基因組DNA送檢上海生工生物有限公司進(jìn)行BSP分析。尿路感染組和健康對(duì)照組各送檢12例樣本,每例樣本檢測(cè)5個(gè)克隆。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組VDR mRNA表達(dá)水平比較 尿路感染組患兒VDR mRNA表達(dá)水平為0.096±0.015,高于健康對(duì)照組嬰兒的0.046±0.009,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖 1。

    圖1 兩組VDR mRNA表達(dá)水平比較

    2.2 兩組DNMTs mRNA表達(dá)水平比較 尿路感染組患兒DNMT1 mRNA表達(dá)水平為0.034±0.006,低于健康對(duì)照組嬰兒的0.057±0.009,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2。尿路感染組患兒 DNMT3a mRNA表達(dá)水平為0.056±0.009,健康對(duì)照組嬰兒為0.072±0.010,兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖3。尿路感染組患兒DNMT3b mRNA表達(dá)水平為0.038±0.005,低于健康對(duì)照組嬰兒的 0.045±0.007,兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖4。

    2.3 兩組VDR基因甲基化水平比較 BSP檢測(cè)結(jié)果顯示,VDR基因片段中共含有13個(gè)CpG位點(diǎn)。12例尿路感染組患兒VDR基因啟動(dòng)子的甲基化水平為(0.00±0.00)%,而健康對(duì)照組嬰兒VDR基因啟動(dòng)子的甲基化水平為(5.31±8.19)%,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示尿路感染患兒的VDR基因啟動(dòng)子呈低甲基化狀態(tài),見(jiàn)圖5。

    圖2 兩組DNMT1 mRNA表達(dá)水平比較

    圖3 兩組DNMT3a mRNA表達(dá)水平比較

    圖4 兩組DNMT3b mRNA表達(dá)水平比較

    圖5 兩組VDR基因甲基化水平比較

    3 討論

    VDR是介導(dǎo)維生素D發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)生物大分子,屬于甲狀腺激素受體和類(lèi)固醇激素受體的超家族成員。既往研究發(fā)現(xiàn)維生素D缺乏與嬰兒尿路感染相關(guān)[8],本研究探討了VDR與嬰兒尿路感染的關(guān)系,結(jié)果提示尿路感染患兒VDR mRNA表達(dá)水平升高。這可能與機(jī)體通過(guò)提高VDR的表達(dá)水平,來(lái)增強(qiáng)維生素D與VDR的結(jié)合,從而彌補(bǔ)尿路感染患兒維生素D不足所帶來(lái)的效應(yīng)。

    為進(jìn)一步探討尿路感染患兒VDR mRNA表達(dá)增高的機(jī)制,筆者進(jìn)一步研究了DNA甲基化對(duì)VDR基因啟動(dòng)子的調(diào)控作用。筆者采用BSP檢測(cè)VDR啟動(dòng)子的甲基化水平,發(fā)現(xiàn)12例尿路感染組患兒VDR基因啟動(dòng)子為完全低甲基化,甲基化水平為(0.00±0.00)%;而健康對(duì)照組嬰兒VDR基因啟動(dòng)子甲基化水平為(5.31±8.19)%。因此尿路感染患兒VDR基因啟動(dòng)子呈低甲基化狀態(tài),導(dǎo)致VDR mRNA表達(dá)水平增高,從而影響維生素D與VDR的結(jié)合。由此推測(cè)尿路感染患兒的VDR基因表達(dá)受DNA甲基化水平的影響,DNA低甲基化水平促進(jìn)VDR基因的表達(dá)。

    DNA甲基化通常發(fā)生在CpG二核苷酸的5′側(cè)胞嘧啶上,而絕大多數(shù)CpG位點(diǎn)在細(xì)胞的整個(gè)生命周期中保持著甲基化狀態(tài)[9]。CpG島的位置主要處于基因啟動(dòng)子區(qū)域,且CpG島的甲基化可直接導(dǎo)致相關(guān)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄沉默[10]。既往研究表明VDR基因甲基化異常可能與某些疾病的發(fā)生相關(guān),例如乳腺癌患者的VDR基因甲基化異??赡芘c化療耐藥相關(guān)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)VDR基因甲基化異常與嬰兒尿路感染相關(guān)。

    DNMTs是催化DNA甲基化的主要反應(yīng)酶,包括DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 和 DNMT3L,它們之間相互協(xié)調(diào),共同維持基因組DNA的甲基化穩(wěn)定[11]。在正常成人組織中,DNMT1呈持續(xù)性低表達(dá)狀態(tài),DNMT3a與DNMT3b呈失表達(dá)或低表達(dá)狀態(tài);而在癌細(xì)胞中DNMTs呈過(guò)度表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜樣腺癌中,DNMT1、DNMT3b的表達(dá)水平比正常組織升高2~4倍[12]。本研究對(duì)DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)尿路感染患兒的DNMT1 mRNA表達(dá)水平降低,而DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異,提示DNMT1表達(dá)水平降低可能與尿路感染患兒VDR基因啟動(dòng)子的低甲基化水平相關(guān)。

    綜上所述,筆者推測(cè)尿路感染患兒DNMT1表達(dá)水平降低導(dǎo)致VDR基因啟動(dòng)子的低甲基化水平,從而引起VDR mRNA表達(dá)水平升高。本研究從表觀遺傳學(xué)水平上探討了VDR基因表達(dá)調(diào)控的可能機(jī)制,為今后深入研究表觀遺傳學(xué)與VDR基因表達(dá)的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。由于本研究是基于臨床的病例對(duì)照分析,可能存在樣本偏差,今后需要更大的臨床樣本數(shù)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

    [1]翟榮群.兒童尿路感染相關(guān)因素研究新進(jìn)展[J].中華小兒外科雜志,2015,36(10):796-800.doi:10.3760/cma.j.issn.0253-3006.2015.10.021.

    [2]Coleman LA,Mishina M,Thompson M,et al.Age,serum 25-hydroxyvitamin D and vitamin D receptor(VDR)expression and function in peripheral blood mononuclear cells[J].Oncotarget,2016,7(24):35512-35521.doi:10.18632/oncotarget.9398.

    [3]Zhu T,Liu TJ,Shi YY,et al.Vitamin D/VDR signaling pathway ameliorates 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis by inhibiting intestinalepithelialapoptosis[J].Int J MolMed,2015,35(5):1213-1218.doi:10.3892/ijmm.2015.2150.

    [4]Slattery ML,Wolff RK,Herrick JS,et al.Calcium,vitamin D,VDR genotypes,and epigenetic and genetic changes in rectal tumors[J].Nutr Cancer,2010,62(4):436-442.doi:10.1080/01635580903441204.

    [5]Bird A.DNA methylation patterns and epigenetic memory[J].Genes Dev,2002,16(1):6-21.doi:10.1101/gad.947102.

    [6]白劍.DNA甲基化與食管癌的研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué),2016,45(24):3436-3438.doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.044.

    [7]Marik R,Fackler M,Gabrielson E,et al.DNA methylation-related vitamin D receptor insensitivity in breast cancer[J].Cancer Biol Ther,2010,10(1):44-53.doi:org/10.4161/cbt.10.1.11994.

    [8]Yang J,ChenG,Wang D,etal.Lowserum25-hydroxyvitaminDlevel and risk ofurinary tract infection in infants[J].Medicine(Baltimore),2016,95(27):e4137.doi:10.1097/MD.0000000000004137.

    [9]王瑞嫻,徐建紅.基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化[J].遺傳,2014,36(3):191-199.doi:10.3724/SP.J.1005.2014.0191.

    [10]Tang Y,Jiang S,Gu Y,et al.Promoter DNA methylation analysis reveals a combined diagnosis of CpG-based biomarker for prostate cancer[J].Oncotarget,2017,8(35):58199-58209.doi:10.18632/oncotarget.16437.

    [11]Jia D,Jurkowska RZ,Zhang X,et al.Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation[J].Nature,2007,449(7159):248-251.doi:10.1038/nature06146.

    [12]Xiong Y,Dowdy SC,Xue A,et al.Opposite alterations of DNA methyltransferase gene expression in endometrioid and serous endometrial cancers[J].Gynecol Oncol,2005,96(3):601-609.doi:https://doi.org/10.1016/j.ygyno.2004.11.047.

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