虎糞便類固醇激素檢測及影響因素的評估

傅文源

(福建梅花山華南虎繁育研究所，龍巖，364201)

糞便的主要成分包括食物殘渣、腸道微生物、脫落的腸上皮細胞、細菌發(fā)酵產(chǎn)物、電解質(zhì)以及微量的激素等。野生動物研究中，因為收集糞便相對容易，且不損傷動物，所以，糞便成分分析就成為常用研究手段，如分析動物的食性［1－2］、腸道微生物群落結(jié)構(gòu)［3］、寄生蟲［4］、病原體［5］、DNA 信息［6］、礦物質(zhì)元素［7］等。此外，激素是糞便分析的一個重要方面，通過分析腎上腺皮質(zhì)激素來了解動物的應(yīng)激性［8－9］，以及通過性激素的分析來判斷動物的繁殖生理狀態(tài)［10－14］都是常見的研究策略。

糞便激素分析受到很多因素的影響，如糞便不同部位激素的含量存在差異［15］，糞便所處的環(huán)境溫度、濕度、從排出到采集的時間長短以及是否受到尿液或其他污染［16］等，也是造成激素含量波動的主要原因。

虎(Panthera tigris)是重要的瀕危物種，性情兇猛，研究其繁殖活動時，主要依據(jù)糞便中的性激素含量［12］?；⒌募S團較大，且含有較多的毛發(fā)，基本具備了與大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)糞便類似的結(jié)構(gòu):表層含有更多的腸道脫落細胞和黏膜碎片。如果像大熊貓一樣［15］，糞團內(nèi)激素非均一分布，則激素分析時樣品擇取部位就會對結(jié)果產(chǎn)生影響。動物的生理具有明顯的日節(jié)律。如果一天之內(nèi)不同時間排出的糞便激素含量存在較明顯的差異，那么，這直接就會成為用糞便激素來監(jiān)測動物生理狀況時的一個影響因素。此外，虎時而會排出巧克力狀糞便，這類糞便中的激素含量也可能與正常糞便有所不同。但是，上述因素的影響在虎的糞便激素分析中尚未被系統(tǒng)評估，進而影響對激素檢測結(jié)果的解析。

本研究以人工飼養(yǎng)的東北虎(P.t.altaica)和華南虎(P.t.amoyensis)的糞便為材料，針對糞便的不同部位、采集時間、糞便含水量這3個因素，研究其對性激素分析效果的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2013年5月中旬至12月底，從上海動物園、福建梅花山華南虎繁育研究所采集9只成年雌性華南虎糞便樣品;2013年1月上旬至2014年3月上旬，從黑龍江東北虎林園采集18只成年雌性東北虎糞便樣品;2014年6月底至9月中旬從中國橫道河子貓科動物飼養(yǎng)繁育中心采集6只成年雌性東北虎糞便樣品。所有的虎都曾繁殖過至少1胎，處于較佳的健康狀態(tài)。

1.2 糞便樣品的采集

采集前一天將內(nèi)舍地面用清水沖洗干凈，傍晚把虎收回舍內(nèi)，翌日清晨5:00開始檢查排便情況。在糞便排出后30 min內(nèi)采集完畢。操作時，用鑷子夾取糞團，小心裝入封口袋中。每采集一次，鑷子用衛(wèi)生紙和酒精棉擦拭干凈。用油性記號筆在封口袋上標記虎的編號、采集日期和地點等信息。同時在實驗記錄本上記錄糞便樣品的基本信息，包括采集地點、虎的編號、采集日期、溫度、糞便形狀、干燥和稀便等。采集后將樣品袋放入冷藏箱中暫存2～3 h后，轉(zhuǎn)入－20℃冰柜內(nèi)保存。

1.3 糞便類固醇激素的提取與測定

1.3.1 糞便類固醇激素的提取

糞便中孕酮、雌二醇、睪酮等類固醇激素的提取參考郎冬梅等［17］、李瓊［18］提取激素的方法，并進行了改進。將糞便從－20℃冰柜中取出，室溫下解凍。剔除毛發(fā)、骨頭碎片、植物碎片等雜物后，置于研磨缽中，充分研磨粉碎并混合均勻。用電子天秤稱取約1.5 g樣品于15 mL離心管中，加入10 mL濃度為90%的甲醇溶液，在渦旋震蕩儀上充分震蕩1 min，置于60℃的恒溫水浴鍋中溫浴20 min。之后在離心機中以2000 rpm離心10 min，取上清液于新的離心管中，置于－20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

同時，取大小約為10 cm ×10 cm的潔凈牛皮紙若干，于105℃下烘至恒重。取10 g左右同一糞便樣品，放置于已知重量的牛皮紙上，在分析天平上準確稱重后，扣除牛皮紙的重量，得到糞便的濕重。將糞便放入烘箱中105℃烘至恒重，然后計算糞便含水量。再按照含水量推算每份提取激素的糞便樣品的干重，用于計算激素含量(ng/g_dry或μg/g_dry)作為最終結(jié)果。

1.3.2 類固醇激素的測定方法

采用酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)測定上述各待測樣品。測量前將孕酮、雌二醇和睪酮待測樣品用pH=7.4的0.02 mol/L的磷酸緩沖液稀釋5×，然后用96孔酶聯(lián)免疫診斷試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)對睪酮和雌二醇進行測量，操作按照說明書進行。先重復(fù)測定2個數(shù)據(jù)，遇到有兩個結(jié)果相差較大的數(shù)據(jù)重新檢測。

所用試劑盒主要參數(shù)包括:孕酮測定范圍0～20 ng/mL，靈敏度≤0.005 ng/mL，變異系數(shù)CV＜15%，與孕酮、雌二醇、DHT沒有交叉反應(yīng);雌二醇測定范圍0～1000 pg/mL，靈敏度≤25 pg/mL，變異系數(shù)CV＜15%，與孕酮、雌三醇無交叉反應(yīng);睪酮測定范圍0～20 ng/mL，靈敏度≤0.005 ng/mL，變異系數(shù)CV＜15%，與孕酮、雌二醇、DHT沒有交叉反應(yīng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Microsoft Excel 2003對每個樣品測得的OD450nm值進行初步整理，通過標準曲線的方程用OD值計算出激素的濃度值，然后根據(jù)糞便樣品的干重計算出干糞中所含測量指標的濃度，其中每種激素在檢測時均符合標準曲線，r2值均大于0.98，證明ELISA方法可靠。用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)的特征用均值±標準差的形式表現(xiàn)。

因為樣品采集時間跨度較長，為了消除虎生理時期激素水平的影響［19］，均采用同一個樣品不同部位之間的比較，或者同一只個體同一天上午和下午所排糞便之間進行比較。多重比較采用單因素重復(fù)測量方差分析(One-way repeat measure anova)，首先通過箱式圖的方法對3個部位的激素含量是否有異常值進行檢驗，通過Shapiro-Wilk方法對是否近似符合正態(tài)分布進行檢驗，采用Mulchily's test檢驗是否符合球形假設(shè)。對不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)通過Log轉(zhuǎn)換進行正態(tài)化后再進行檢驗。最后，進行單因素重復(fù)測量多重比較，置信度進行 Bonferroni校正，即 α=0.05/2=0.025。以Pearson's correlation test進行雙變量相關(guān)分析，顯著性水平均設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 糞便不同部位3種類固醇激素的含量差異

本部分研究以2013年5月中旬至12月底，從上海動物園、福建梅花山華南虎繁育研究所采集的9只成年雌性華南虎糞便樣品為材料。對糞便表層及內(nèi)部的3種類固醇激素水平測定結(jié)果如圖1A。糞團表層睪酮含量為(99.38±35.52)ng/g干重，中層含量為(102.92±51.74)ng/g干重，中心的含量為(77.49±31.07)ng/g干重。通過對數(shù)轉(zhuǎn)換將數(shù)據(jù)正態(tài)化后進行單因素重復(fù)測量方差分析，結(jié)果顯示，數(shù)據(jù)滿足球形假設(shè)(χ2=0.345，P=0.841)，且各個水平總體上無顯著差異(F=1.614，P=0.239)。多重比較顯示，糞便表層與中層之間(P=1.000)、中層與中心之間(P=0.282)、表層與中心之間(P=0.824)亦均無顯著差異。

糞團表層雌二醇含量為(421.84±104.19)ng/g干重，中層含量為(293.72±158.68)ng/g干重，中心的含量為(365.72±125.33)ng/g干重。通過對數(shù)轉(zhuǎn)換將數(shù)據(jù)正態(tài)化后進行單因素重復(fù)測量方差分析，結(jié)果顯示，數(shù)據(jù)滿足球形假設(shè)(χ2=2.239，P=0.326)，且各個水平總體上無顯著差異(F=1.581，P=0.253)。多重比較顯示，糞便表層與中層之間(P=0.316)、中層與中心之間(P=1.000)、表層與中心之間(P=1.000)亦均無顯著差異，如圖1B。

糞團表層孕酮含量為(2.04±2.27)μg/g干重，中層含量為(1.04±0.96)μg/g干重，中心的含量為(2.12±2.14)μg/g干重。通過對數(shù)轉(zhuǎn)換將數(shù)據(jù)正態(tài)化后進行單因素重復(fù)測量方差分析，結(jié)果顯示，數(shù)據(jù)滿足球形假設(shè)(χ2=5.595，P=0.061)，且各個水平總體上無顯著差異(F=1.511，P=0.267)。多重比較顯示，糞便表層與中層之間(P=0.128)、中層與中心之間(P=1.000)、表層與中心之間(P=1.000)亦均無顯著差異，如圖1C。

圖1 華南虎糞團不同部位3種類固醇激素含量的差異Fig.1 Comparisons of the contents of three steroid hormones among different sections of the south China tiger fecal pellets

以上結(jié)果顯示，睪酮在糞團中的分布呈現(xiàn)出從外層到中央逐漸遞減的趨勢，但是相鄰部分之間無顯著差異，說明是一種漸變的狀態(tài)。其他兩種激素并未呈現(xiàn)出這種趨勢。因此，為了在實際操作中減少測定結(jié)果的變異性，后續(xù)試驗中將糞便進行了均質(zhì)化處理，即將整個糞團進行攪拌混勻后隨機獲取分析樣品。

2.2 采集時間對激素含量測定結(jié)果的影響

本部分研究以2014年6月底至9月中旬在中國橫道河子貓科動物飼養(yǎng)繁育中心采集6只雌虎糞便樣品為材料，同一個體分別采集了上午(8:30～10:30)和下午(15:00～17:00)兩個時間段排出的糞便，經(jīng)過均質(zhì)化處理后隨機采樣進行激素檢測。

對比分析發(fā)現(xiàn)雌二醇含量在上午和下午之間無顯著相關(guān)性(r=0.384，P=0.523)，同時檢測到雌二醇含量在上午略高于下午，但未達到顯著差異(均值上午=(17.797±21.899)μg/g_dry，均值下午=(6.678±3.731)μg/g_dry，t=1.198，P=0.297)。也就是說，雌二醇水平的高與低與上、下午采集的糞便沒有直接的關(guān)聯(lián)性，也沒有明顯的差異性。

與雌二醇相反，孕酮含量在上午糞便和下午糞便之間有著極顯著的相關(guān)性(r=0.992，P=0.001)。同時，上午糞便中的含量顯著高于下午糞便的含量(均值上午=(5189.992±7365.555)ng/g_dry，均值下午=(3612.589 ±7136.482)ng/g_dry，t=3.765，P=0.020)。

糞便中睪酮含量在上午和下午之間有著極顯著的相關(guān)性(r=0.989，P=0.001)，上午樣品的含量略高于下午，但是未達到顯著水平(均值上午=(287.096±465.516)ng/g_dry，均值下午=(129.901±234.442)ng/g_dry，t=1.487，P=0.211)。

這一結(jié)果顯示，糞便排出后，在環(huán)境中存放時間對性激素的水平存在一定的影響，因為大部分虎都在晨間排便，而且該糞便是上一次排便后至本次排便前大約24 h積累效應(yīng)，因此更為有效。下午所排糞便有的是一天之內(nèi)的首次排便，有的是第2次排便。因此二者之間有著較大的差異。鑒于大部分虎都是早上排便，而早晨所排糞便中激素含量較高，有利于分析動物的生理狀態(tài)，建議采用上午采集的糞便作為正式試驗的樣品。

2.3 糞便的性狀對測定結(jié)果的影響

因為虎的糞便經(jīng)常在同一糞團上，有些部分比較干燥、成形，而另一部分水分較大，比較黏稠，且無固定形狀。選取2013年1月上旬至2014年3月上旬從黑龍江東北虎林園采集18只成年雌性東北虎糞便樣品，研究糞便中較干的有形部分和較為黏稠的無形部分進行激素含量的比較分析。從變化趨勢上看，有形部分和無形部分的雌二醇含量之間沒有顯著的相關(guān)性(r=0.132，P=0.602)，而孕酮和睪酮兩種激素在有形和無形的部分則有著極為顯著的相關(guān)性(r孕酮=0.800，P=0.000;r睪酮=0.797，P=0.000)。

經(jīng)配對樣本t檢驗，發(fā)現(xiàn)雌二醇在糞便有形部分均值為(232.093±178.807)μg/g_dry，無形部分均值為(276.713±152.542)μg/g_dry，二者之間無顯著差異(t=－0.864，P=0.400)。孕酮含量在有形部分均值為(10.171±14.100)μg/g_dry，無形部分均值為(8.025±9.669)μg/g_dry，二者之間無顯著差異(t=0.974，P=0.344)。睪酮含量在有形部分均值為(101.654±140.000)ng/g_dry，無形部分均值為(69.452±42.653)ng/g_dry，二者之間無顯著差異(t=0.928，P=0.366)。

3 討論

糞便的形成在大腸后段，主要成分是食物殘渣、細菌和腸道脫落物等。在糞便形成早期，隨著腸道的蠕動，各類組分得到充分混合，而進入腸道后段隨著水分重吸收，逐漸成形、硬化。硬化后的糞便會在腸道內(nèi)保存較長時間，此時糞便一部分與腸管有不同程度的接觸，而有些部分則再無機會與腸管接觸，至此，就會形成結(jié)構(gòu)性差異，進而影響類固醇激素的分布，這在很多草食動物的研究中得到證實。譬如大熊貓糞團中不同部位雌二醇、睪酮、皮質(zhì)醇激素的含量不同［15］。

可以推測，糞便中的類固醇激素主要來源于腸組織，其濃度與血液中同種激素的水平直接相關(guān)［20］?？梢酝茰y，隨著時間的延長，與腸黏膜直接接觸的糞便表層可能積累較多的激素，而糞便中心部分則含量相對較少。本研究的結(jié)果顯示，睪酮、雌二醇和孕酮的含量在糞便表層、中層和中心之間未檢測到顯著差異(P=0.061～0.253，圖1)，這提示，在檢測雌虎糞便中類固醇激素含量時，可以不考慮不同部位的含量差異。因為虎糞便含有大量被毛時，結(jié)構(gòu)相當緊實，刻意獲取外層糞便時操作比較復(fù)雜。所以，不考慮部位差異性可以提高操作的便捷性。

糞便在比較溫和的環(huán)境中(如室溫條件下)存放時間長短對激素含量的影響已有很多研究。糞便中的孕酮在室溫下24 h內(nèi)會發(fā)生顯著的降解［21］。在有氧狀態(tài)下雌二醇的半衰期僅為4～12 h，而在無氧環(huán)境下降解極為緩慢［22］。當新鮮糞便暴露在空氣中時，最外面的激素處于有氧狀態(tài)下，如果未能立即進行無氧處理，都會在短期內(nèi)喪失殆盡。而表面以下的激素，如果糞團比較緊密而處于無氧狀態(tài)，就會得到有效保留，如果比較松散，則會逐漸降解。一些實驗無論在室溫下還是在低溫下保存糞便都發(fā)現(xiàn)較多的降解，可能與此有關(guān)［23－26］。同時，激素在腸道和糞便中的消解主要因為微生物的作用［27］，因此，樣品保存中通過低溫等方式抑制微生物的活力是非常必要的。

虎夜間排便較少，更多的是在清晨。此時的糞便應(yīng)該在腸道存留時間較長，積累的激素總量可能較多。那么在腸道期間就會形成一邊積累、一邊消解的動態(tài)局面。如果糞便中檢測到較高的激素水平，表明激素分泌和累積的速度整體上高于消解的速度。下午所排糞便往往是在上午排便之后重新形成的，激素累積時間較短，則其表觀的激素水平就會略低。本研究中，3種類固醇激素在上午所排糞便中的含量均略高于下午所排糞便，符合這一趨勢，但只有孕酮達到了顯著水平(t=3.765，P=0.020)，所以，除了孕酮之外，另外兩種激素并不太受排便時間的影響。所以，如果只檢測雌二醇和睪酮時，則采用上午或下午的糞便均可，但要檢測孕酮，則必須確定一個一致的糞便排出時間，避免更多的誤差。在實際工作中，因為大多數(shù)虎都會在早晨排便，為了便捷起見，可以統(tǒng)一采用早晨排出的糞便。

糞便含水量的差異一直是影響激素檢測的重要因素。因此，為了消除含水量引起的誤差，最后都統(tǒng)一換算成單位干重糞便中的含量［15］。從糞便形成過程來看，含水量越高，糞便越稀，表明在腸道中保留的時間越短，激素積累的量會越少。但本實驗結(jié)果否定了這一推測，同一個糞便中較干燥的部分和較黏稠的部分中，類固醇激素含量沒有顯著差異。也就是說，糞便激素只要積累時間和消解速度一致，無論含水量多高，換算成干重含量時檢測結(jié)果不受影響。

綜合上述結(jié)果，我們建議在通過糞便監(jiān)測虎類固醇激素水平時，首先要確定糞便采集的時間，最好采集早晨的糞便;第二，鑒于激素分布有差異傾向，以及不同含水量對干重含量沒有影響，建議分析時將整個糞便樣品做均質(zhì)化處理，然后隨機取樣。

致謝:本研究中東北林業(yè)大學(xué)的石許秀、馬躍、徐艷春等在實驗中提供了很多幫助，上海動物園的袁耀華、劉群秀、李清，黑龍江東北虎林園的劉丹、馬國慶，福建梅花山華南虎繁育研究所的林開雄、蘭作閩等在樣品采集中給予了大力協(xié)助，在此對上述單位和個人表示衷心感謝。

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