蘇子降氣湯對COPD氣道黏液高分泌大鼠MUC5AC、AQP5的影響

付海晶 曲妮妮

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是以持續(xù)的氣流受限為特征，病程遷延難愈，常反復(fù)發(fā)作的一類疾病。COPD重要的病理生理特點(diǎn)為氣道黏液高分泌。COPD的發(fā)病率和死亡率逐年上升，這與氣道黏液過度分泌有著密切的聯(lián)系［1］。當(dāng)黏液過度分泌及流變學(xué)特性發(fā)生改變時(shí)，患者就會(huì)出現(xiàn)氣體交換功能障礙、氣流受限等情況，使病情進(jìn)行性加重，甚至導(dǎo)致患者死亡［2］。因此，氣道黏液高分泌作為COPD重要危險(xiǎn)因素之一，嚴(yán)重影響著患者的預(yù)后和生活。氣道黏液的彈性主要由黏蛋白所決定，即由上皮杯狀細(xì)胞、黏膜下腺分泌物及組織液所構(gòu)成。近幾年，氣道黏液高分泌作為研究的熱點(diǎn)問題越來越受到學(xué)者們的重視，其中黏蛋白5AC（MUC5AC）與氣道黏液高分泌關(guān)系最為密切，是研究的重要環(huán)節(jié)［3-5］。水通道蛋白參與了氣道水液的代謝全過程，對氣道表面液體的調(diào)節(jié)及鼻咽部分泌物的產(chǎn)生有著密切的聯(lián)系，并起著重要的作用。水通道蛋白5（AQP5）作為黏蛋白水鹽比例失衡的關(guān)鍵因素，影響著氣道黏液的黏稠度與黏液纖毛清除率，與氣道黏液分泌及水液轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)系密切。臨床試驗(yàn)表明，蘇子降氣湯可減輕患者咳、痰、喘等臨床癥狀，祛痰效果顯著［6-7］。因此，本研究通過煙熏聯(lián)合氣道內(nèi)滴注脂多糖（LPS）建立COPD氣道黏液高分泌大鼠模型，觀察蘇子降氣湯對大鼠肺組織中MUC5AC和AQP5的表達(dá)情況，并初步探討其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用SPF級Wister雄性大鼠，32只，體質(zhì)量（250±20）g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號：SCXK（遼）2015-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

蘇子降氣湯（紫蘇子9 g，法半夏9 g，當(dāng)歸6 g，前胡 6 g，厚樸 6 g，甘草 6 g，肉桂 3 g，生姜 3 g，紫蘇葉2 g，大棗1枚）由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診藥局提供，并制備濃縮成3.6 kg/L，貯于冰箱備用。富露施 （乙酰半胱氨酸泡騰片），意大利贊邦集團(tuán)，規(guī)格：0.6 g/片。將富露施配置成含生藥量10.8 g/L，批號28003318。

1.3 試劑及儀器

LPS（Sigma公司）；大前門牌香煙（上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司）；DAB試劑盒、即用型SABC-POD（兔IgG）試劑盒、胃黏液素抗體 （MUC5AC Antibody）、AQP5抗體（AQP5 Antibody）均購于武漢博士德生物工程有限公司；全自動(dòng)脫水機(jī)、轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)、展片機(jī)、石蠟包埋機(jī)、數(shù)碼顯微鏡、電子天平（均為德國Leica生產(chǎn)）；自制熏煙箱（50 cm×50 cm×40 cm 的透明有機(jī)玻璃箱）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件。

1.4 分組及造模

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，即空白組、模型組、西藥組、中藥組，每組各8 只，并進(jìn)行標(biāo)記。 參考王駿［8］和方蘇榕［9］的造模方法，即大鼠氣道滴注脂多糖聯(lián)合香煙煙熏的方法建立COPD氣道黏液高分泌的動(dòng)物模型（空白組除外）。具體方法：實(shí)驗(yàn)第1、14日向大鼠氣管內(nèi)滴注LPS溶液0.2 mL（200 μg/L），第 2～13、15～30 日將大鼠放入自制的熏煙箱內(nèi)進(jìn)行熏煙，煙熏箱的箱頂及兩側(cè)各有一個(gè)直徑5 cm的通氣孔與外界相連，手動(dòng)燃燒大前門牌香煙，由管子將煙霧導(dǎo)入煙熏箱內(nèi)，依次熏煙燃香煙8支，每次放入8只大鼠，熏煙30 min，煙霧濃度約為5%，每日1次，共28 d。

1.5 給藥方法

實(shí)驗(yàn)第31日開始進(jìn)行灌胃。大鼠給藥劑量是成人60 kg，大鼠250 g計(jì)算，根據(jù)1∶7的人與動(dòng)物藥量折算系數(shù)，推算出等效劑量［10］?？瞻捉M正常飼養(yǎng)，其余3組分別給予0.9%氯化鈉注射液5 mL/kg、富露施藥液5 mL/kg、蘇子降氣湯5 mg/kg灌胃，每日1次，連續(xù)2周。

1.6 標(biāo)本采集與檢測

各組大鼠在末次給藥后禁食12 h，給予10%水合氯醛麻醉處死，常規(guī)留取肺組織，每組選取6只進(jìn)行檢測。左肺組織經(jīng)固定、切片后分別進(jìn)行HE染色和ABPAS染色以及免疫組織化學(xué)檢測。

1.6.1 HE染色 將已經(jīng)包埋的切片經(jīng)二甲苯脫蠟，用梯度濃度的酒精溶液進(jìn)行脫水，放入蘇木精溶液進(jìn)行浸染，水洗后，再放入伊紅中染色（顏色由藍(lán)變紅），用95%的酒精去除殘色，無水乙醇脫水，二甲苯透明1 min，最后用中性樹膠封片進(jìn)行觀察。

1.6.2 AB-PAS染色 將包埋后的肺組織切成5 μm厚的切片，然后行常規(guī)的脫蠟、脫水、水洗，阿爾辛藍(lán)溶液染色15～25 min，蒸餾水沖洗，Schiff溶液染色15～25 min，蒸餾水沖洗干凈，經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封固。用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖文分析，以觀察杯狀細(xì)胞的增生情況。

1.6.3 檢測大鼠肺組織中MUC5AC、AQP5的蛋白表達(dá)水平 右肺組織切片常規(guī)脫蠟，DAB顯色，AQP5、MUC5AC抗體緩沖液稀釋均為1∶200。以檸檬酸行抗原修復(fù)，用DAB染色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，樹脂封片。顯微鏡下進(jìn)行觀察，拍照，陽性部位呈棕黃色，并插入圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，各組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變

見圖1。HE染色后光鏡下可見空白組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)及完整，大小均勻；黏膜上皮完整，上皮細(xì)胞無脫落、變性；黏膜下腺無增生、肥大；肺泡腔及間隙無出血、水腫及炎癥細(xì)胞滲出；管壁清楚，無萎縮、斷裂，周圍無炎性浸潤。模型組肺組織及支氣管黏膜出現(xiàn)水腫、充血，上皮細(xì)胞倒伏、脫落，支氣管管壁增厚，管腔狹窄，肺泡壁變薄、斷裂，大量融合成大皰，氣道內(nèi)有大量黏液分泌，并伴有多種炎癥細(xì)胞滲出，以中性粒細(xì)胞為主；與模型組相比，中藥組上皮結(jié)構(gòu)基本完整，肺泡結(jié)構(gòu)大部分正常，小部分有充血，氣道內(nèi)黏液分泌減少，管腔內(nèi)可見輕微變性并伴有增厚，上皮細(xì)胞少量脫落，部分纖毛出現(xiàn)粘連、倒伏、脫落，杯狀細(xì)胞增生，肺泡間隔變薄，相鄰肺泡融合顯著減輕，支氣管壁輕微水腫，以淋巴細(xì)胞浸潤為主；西藥組纖毛粘連、倒伏、脫落，上皮細(xì)胞存在死亡脫落，杯狀細(xì)胞增生程度減輕，支氣管壁淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡間隔明顯變薄，相鄰肺泡融合與模型組相比減輕，肺間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤、充血。

圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)（HE染色，200倍）

2.2 各組大鼠杯狀細(xì)胞水平表達(dá)比較

見圖2。PAS檢測結(jié)果顯示，空白組大鼠肺組織未見杯狀細(xì)胞，無明顯黏液分泌；模型組可見杯狀細(xì)胞增生，并分泌較多黏液，并有大量黏液栓形成，說明模型組大鼠存在氣道黏液高分泌；與模型組相比，西藥組和中藥組杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，提示蘇子降氣湯能抑制氣道黏液高分泌，減輕氣道阻塞，改善肺通氣功能，與西藥效果接近。

2.3 肺組織中MUC5AC、AQP5蛋白表達(dá)水平比較

圖2 各組大鼠杯狀細(xì)胞（AB-PAS染色，400倍）

見圖3～圖4，表1。MUC5AC蛋白陽染顆粒為棕黃色?？瞻捉MMUC5AC表達(dá)不明顯，模型組MUC5AC表達(dá)明顯，蘇子降氣湯和西藥富露施治療后MUC5AC的表達(dá)明顯下降。AQP5蛋白陽染顆粒為棕黃色。空白組AQP5表達(dá)明顯，模型組AQP5表達(dá)不明顯，蘇子降氣湯組和富露施組AQP5蛋白表達(dá)水平下降；如表，與空白組相比，模型組大鼠MUC5AC水平升高、AQP5水平下降（P＜0.05）；與模型組相比，中西藥各治療組大鼠肺組織中MUC5AC水平下降、AQP5水平上升（P＜0.05），說明中、西藥治療組對 MUC5AC、AQP5有不同程度的改善；中藥組與西藥組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中藥組與西藥組療效相近。

表1 各組大鼠肺組織中MUC5AC、AQP5蛋白水平比較（±s）

表1 各組大鼠肺組織中MUC5AC、AQP5蛋白水平比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，與西藥組比較。

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圖3 各組大鼠支氣管、肺組織MUC5AC蛋白表達(dá)（免疫組化，200倍）

圖4 各組大鼠肺組織中AQP5蛋白的表達(dá)情況（免疫組化，200倍）

3 結(jié) 論

氣道黏液高分泌是以COPD為代表的氣道慢性炎癥性疾病的重要病理生理特征之一，可由多種細(xì)胞信號通路共同參與和調(diào)節(jié)。過度分泌的黏液使氣道微環(huán)境發(fā)生改變，為氣道內(nèi)的病毒、細(xì)菌等微生物提供了生存條件，并使氣道內(nèi)的殺菌微環(huán)境遭到破壞，同時(shí)令纖毛清除功能受損，使氣道內(nèi)的感染不易控制；而感染后的炎癥產(chǎn)物又會(huì)進(jìn)一步過度分泌氣道黏液而引起加重感染，如此形成惡性循環(huán)，加重了COPD患者的住院率和死亡率［11-12］。氣道黏液高分泌貫穿于COPD疾病的始終，已成為影響COPD患者肺功能、住院率、死亡率、康復(fù)與預(yù)后的重要因素。

COPD屬中醫(yī)學(xué)“肺脹”范疇，氣道黏液高分泌是對COPD的特定病理學(xué)描述，雖然中醫(yī)無此概念，但與中醫(yī)學(xué)中“痰飲”有著密切的聯(lián)系，且兩者本質(zhì)上有相似之處。臨床上，COPD患者可出現(xiàn)咳嗽、咯大量白色或者泡沫樣痰等臨床表現(xiàn)，這正與中醫(yī)痰飲證相似，故兩者臨床特征一致。本課題所研究的蘇子降氣湯是治療痰飲咳喘的常用方劑，出自《太平惠民和劑局方》。本方劑為降氣劑，具有降氣化痰、祛痰止咳之功效，主治痰涎壅盛、咳嗽短氣、胸膈滿悶，咽喉不利等證。據(jù)文獻(xiàn)記載，紫蘇子，辛溫，長于降氣，能治痰涎壅盛之咳喘，為治痰逆喘咳之要藥，現(xiàn)代研究證明其具有化痰止咳之功用；法半夏燥濕化痰降逆；厚樸下氣寬胸除滿，降逆平喘；前胡下氣祛痰止咳，三藥助紫蘇子降氣祛痰平喘之功，共為臣藥。生姜辛溫發(fā)散，降逆化痰，紫蘇葉宣肺行水，肉桂溫腎納氣，當(dāng)歸辛甘溫潤，諸藥合用，上下兼顧，標(biāo)本兼治，氣降痰消，喘咳則平［13］。故討論COPD、氣道黏液高分泌及蘇子降氣湯三者之間的聯(lián)系有一定的臨床意義。

引起黏液高分泌的主要因素是以革蘭陰性桿菌為主要致病菌的呼吸道感染，LPS是革蘭陰性桿菌中的主要致病毒素。LPS存在于大氣中的污染物中，可促進(jìn)肺部疾病的發(fā)展并造成不可逆的氣流阻塞［14-15］。因此，使用LPS氣道滴注大鼠是氣道黏液高分泌的常用動(dòng)物模型。本次實(shí)驗(yàn)，模型組大鼠鏡下可見肺組織有不同程度的充血和水腫，管腔有分泌物和炎性細(xì)胞，肺泡間隔增大，黏膜上皮脫落，杯狀細(xì)胞增生，肺泡數(shù)減少，這些說明了本次成功復(fù)制了COPD氣道黏液高分泌的模型。

MUC5AC位于氣道上皮的杯狀細(xì)胞內(nèi)，是人類氣道內(nèi)主要分泌黏液的蛋白，也是反映杯狀細(xì)胞增生程度的重要指標(biāo)［16］。氣道黏液高分泌中黏液的水與黏蛋白比例失衡可增加黏液中高黏蛋白的含量，使痰液黏稠不易咯出，易加重感染。在肺組織中，AQP5是主要的水轉(zhuǎn)運(yùn)通道，可對黏蛋白的分泌與水/電解質(zhì)的分泌起到相互調(diào)節(jié)的作用。據(jù)報(bào)道，黏液下腺AQP5的減少可以使氣道液體分泌減少和黏蛋白濃度增加［17］。蘇子降氣湯在臨床試驗(yàn)中可明顯減輕患者咳、痰、喘等癥狀，以祛痰效果明顯；藥理研究表明，蘇子降氣湯具有鎮(zhèn)咳、祛痰、解痙的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘇子降氣湯治療后大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯改善、管腔大小得到明顯恢復(fù)、炎性細(xì)胞浸潤程度顯著降低，這正驗(yàn)證了本課題組之前的猜測。同時(shí)AB-PAS染色結(jié)果也提示模型組肺組織杯狀細(xì)胞增多，治療后杯狀細(xì)胞明顯減少。與空白組相比，模型組大鼠肺組織中MUC5AC表達(dá)顯著上升，AQP5表達(dá)顯著下降；而經(jīng)中藥治療后MUC5AC表達(dá)明顯下降，AQP5表達(dá)明顯上升，與西藥效果相仿。因此我們推測蘇子降氣湯可能通過抑制肺組織MUC5AC的表達(dá)，增加AQP5的表達(dá)水平，來調(diào)控氣道黏液高分泌，達(dá)到治療COPD的效果。同時(shí)本研究亦發(fā)現(xiàn)，在高分泌狀態(tài)下，MUC5AC表達(dá)增加，與AQP5呈負(fù)相關(guān)性，提示了MUC5AC的表達(dá)增加或許通過提高杯狀細(xì)胞分泌減少AQP5參與了氣道高分泌過程，至于AQP5和MUC5AC是以何種機(jī)制參加了氣道高分泌過程，還不十分明確，仍需后續(xù)的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

綜上所述，蘇子降氣湯對COPD氣道黏液高分泌大鼠有一定的治療作用，其作用機(jī)制可能通過抑制MUC5AC表達(dá)，增加AQP5蛋白表達(dá)水平，從而達(dá)到治療作用。

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