針灸對1-氯-2，4-二硝基氯苯誘導(dǎo)的小鼠過敏性接觸性皮炎的影響*

余玲玲 肖 明 黃 薏 李 靜

（上海市第八人民醫(yī)院，上海 200235）

過敏性接觸性皮炎（ACD）是職業(yè)性皮膚病，由T細(xì)胞介導(dǎo)的抗原特異性過敏反應(yīng)，以炎性細(xì)胞的浸潤和炎癥因子的釋放為主要特征［1-2］，臨床癥狀主要表現(xiàn)為紅斑、糜爛、結(jié)痂、水腫等。ACD中醫(yī)學(xué)稱之為“漆瘡”“膏藥風(fēng)”“馬桶癬”等［3］，目前臨床上治療 ACD 主要以減輕炎癥反應(yīng)為主，但是不能從根本上抑制其病因、病機。針灸屬于中醫(yī)理論的一部分，通過人體經(jīng)絡(luò)的治療能夠激發(fā)機體自身的調(diào)節(jié)潛能，使人體快速處于正常運行狀態(tài)。有研究表明，針灸對皮炎小鼠具有保護(hù)作用［4］。馬天明研究表明，針灸通過抑制神經(jīng)性皮炎大鼠炎癥反應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮對神經(jīng)性皮炎的改善作用［5］。本研究構(gòu)建ACD小鼠模型，觀察針灸對小鼠ACD的改善作用及對TLR4/NF-kB信號通路的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 BALB/C小鼠72只，SPF級，雌雄各半，4～6周齡，體質(zhì)量15～20 g，購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，許可證號：SYXK（京）2015-0001。保持室內(nèi)通風(fēng)及充足光照，維持18～23℃室溫，30%～60%相對濕度，自由飲水進(jìn)食。

1.2 材料與儀器 1-氯-2，4-二硝基氯苯 （DNCB）購自美國Sigma；咪康唑（批號1610202733）購自西安楊森制藥有限公司；白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-7（IL-7）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒購自上海賽默科技生物發(fā)展有限公司；3K15超低溫離心機購自德國Sigma公司；兔抗鼠Toll樣受體 4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；SZ51奧林巴斯體視顯微鏡購自日本Olympus公司；Leica 1800切片機購自德國Leica公司。

1.3 ACD模型制備 根據(jù)文獻(xiàn)資料［6］，將小鼠固定，在其背部中線左右兩側(cè)同一部位進(jìn)行剪毛（3 cm×3 cm），用0.2 mL 2%的DNCB乙醇溶液涂抹小鼠背部左側(cè)剪毛區(qū)域，正常對照組用乙醇涂抹小鼠右側(cè)剪毛部位，連續(xù)涂抹3 d，每日1次。3 d后，觀察涂抹DNCB背部的皮膚，以出現(xiàn)紅斑作為ACD模型構(gòu)建成功的標(biāo)志。

1.4 分組與干預(yù) 將造模成功的小鼠隨機分成5組，模型組、非經(jīng)絡(luò)針刺組、經(jīng)絡(luò)針灸組、咪康唑組、經(jīng)絡(luò)針灸+咪康唑組，每組12只。經(jīng)絡(luò)針灸組：于模型小鼠膈俞、脾俞、足三里施針，采用管式進(jìn)針法直刺，深度3 mm，平補平瀉手法留針6 min，結(jié)束后將艾條在穴位上方2 cm處懸灸，每個穴位灸3 min［7］。非經(jīng)絡(luò)針刺組：于造模小鼠膈俞、脾俞、足三里穴位旁2 cm處施針并懸灸，每日1次。咪康唑組：于模型小鼠背部涂抹咪康唑，每日3次［8］。經(jīng)絡(luò)針灸+咪康唑組：于模型小鼠膈俞、脾俞、足三里施針并懸灸，于造模小鼠背部涂抹咪康唑，保證與咪康唑組的用藥量一樣。模型組和正常對照組于背部涂抹生理鹽水。持續(xù)治療2周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）ELISA檢測小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-7、TNF-α 的含量。持續(xù)治療 2 周后，所有小鼠禁食12 h，于次日清晨采集各組小鼠尾靜脈血，置于超低溫離心機離心，3000 r/min離心5 min，分離血清。采用ELISA試劑盒檢測血清中IL-2、IL-4、IL-7、TNF-α的含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。2）小鼠皮膚腫脹程度及臟器指數(shù)。持續(xù)治療2周后，每組小鼠各取出3只，記錄其體質(zhì)量（g），將小鼠脫頸椎處死，分別剪下小鼠左側(cè)皮炎區(qū)皮膚以及右側(cè)對照區(qū)域皮膚（含脂肪組織）用直徑6 mm圓形打孔器在皮膚組織上打孔，稱其質(zhì)量（mg），計算皮膚腫脹程度，皮膚腫脹程度=炎癥區(qū)皮膚質(zhì)量-對照區(qū)皮膚質(zhì)量。打開小鼠胸腔，分別取出小鼠胸腺和脾臟，稱其質(zhì)量（mg），計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。3）HE染色檢測皮膚組織病理學(xué)變化。持續(xù)治療2周后，每組取3只小鼠進(jìn)行麻醉，取其背部左側(cè)區(qū)域皮膚，置于10%的中性甲醛溶液固定4 h后，制作石蠟切片，切片厚度5 μm，脫蠟后用蘇木精染色20 min，水洗后，稀氨水（1%）返藍(lán)30 s，然后用1%的鹽酸酒精溶液分化1 min，水洗后，用伊紅染色3 min左右，自來水洗滌1 min，將組織切片逐級脫水后，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于體視顯微鏡下觀察小鼠皮膚組織病理學(xué)變化情況，細(xì)胞核被染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被染成不同程度的紅色。4）皮膚組織中TLR4、NF-κB表達(dá)水平。持續(xù)治療2周后，每組取6只小鼠皮膚組織，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），每孔上樣體積 20 μL，電泳結(jié)束后，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜50 min，分別滴加一抗，置于4℃下過夜，滴加二抗37℃放置1 h。顯影后采集圖像，并采用Gel-Pro analyzer4軟件分析TLR4、NF-kB表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步比較采用q檢驗或Dunnett t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般體征的觀察 造模24 h后，模型組小鼠造模部位皮膚開始出現(xiàn)紅斑，并伴有不同程度水腫；隨著造模時間的延長，皮膚紅斑面積逐漸變大，且水腫加重，正常對照組小鼠背部皮膚未見明顯異常。

2.2 各組小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-7、TNF-α 含量比較 見表1。持續(xù)治療2周后，模型組血清中IL-2、IL-4、IL-7、TNF-α 的含量顯著高于正常對照組（P＜0.05）；經(jīng)絡(luò)針灸組血清中 IL-2、IL-4、IL-7、TNF-α 的含量顯著低于模型組和非經(jīng)絡(luò)針刺組（P＜0.05）；經(jīng)絡(luò)針灸+咪康唑組血清中 IL-2、IL-4、IL-7、TNF-α 的含量顯著低于模型組和咪康唑組（P＜0.05）；經(jīng)絡(luò)針灸+咪康唑組血清中 IL-2、IL-4、IL-7、TNF-α 的含量與經(jīng)絡(luò)針灸組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-7、TNF-α含量比較（pg/mL，±s）

表1 各組小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-7、TNF-α含量比較（pg/mL，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與非經(jīng)絡(luò)針刺組比較，#P＜0.05；與經(jīng)絡(luò)針灸組比較，△P＜0.05；與咪康唑組相比，▲P＜0.05 。 下同。

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2.3 各組小鼠皮膚腫脹程度及臟器指數(shù)的比較 見表2。持續(xù)治療2周后，模型組皮膚腫脹程度、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著高于正常對照組（P＜0.05）；經(jīng)絡(luò)針灸組皮膚腫脹程度、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著低于模型組和非經(jīng)絡(luò)針刺組（P＜0.05）；經(jīng)絡(luò)針灸+咪康唑組皮膚腫脹程度、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著低于模型組和咪康唑組（P＜0.05）；經(jīng)絡(luò)針灸+咪康唑組皮膚腫脹程度、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與經(jīng)絡(luò)針灸組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠小鼠皮膚腫脹程度及臟器指數(shù)比較（±s）

表2 各組小鼠小鼠皮膚腫脹程度及臟器指數(shù)比較（±s）

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2.4 各組皮膚組織病理學(xué)變化 見圖1。持續(xù)治療2周后，正常對照組小鼠皮膚組織各層次清晰，且厚度正常，其結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯的變化；模型組皮膚組織間隙水腫，且炎性細(xì)胞浸潤；與模型組相比，非經(jīng)絡(luò)針刺組和咪康唑組皮膚組織沒有明顯變化，經(jīng)絡(luò)針灸組和經(jīng)絡(luò)針灸+咪康唑組皮膚組織水腫和炎性細(xì)胞浸潤情況減輕。

圖1 各組皮膚組織病理學(xué)變化（HE染色，400倍）

2.5 各組小鼠炎癥皮膚組織中TLR4、NF-κB表達(dá)水平比較 見圖2，表3。持續(xù)治療2周后，模型組皮膚組織中TLR4、NF-κB表達(dá)水平顯著高于正常對照組（P＜0.05）；經(jīng)絡(luò)針灸組組織中TLR4、NF-κB表達(dá)水平顯著低于模型組和非經(jīng)絡(luò)針刺組（P＜0.05）；經(jīng)絡(luò)針灸+咪康唑組皮膚組織中TLR4、NF-κB表達(dá)水平顯著低于模型組和咪康唑組（P＜0.05）；經(jīng)絡(luò)針灸+咪康唑組皮膚組織中TLR4、NF-κB表達(dá)水平與經(jīng)絡(luò)針灸組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 Western blot檢測皮膚組織中TLR4、NF-κB表達(dá)情況

表3 各組小鼠皮膚組織中TLR4、NF-κB表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組小鼠皮膚組織中TLR4、NF-κB表達(dá)水平比較（±s）

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3 討 論

ACD是一種過敏性皮膚病，是由接觸外界致敏原引起的，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ACD的化學(xué)致敏原高達(dá)3000多種，其中包括二硝基氟苯（DNFB）、DNCB和部分芳香族化合物［9］。本研究采用DNCB涂抹小鼠背部的方法構(gòu)建ACD模型，結(jié)果表明，造模24 h后，模型組小鼠造模部位皮膚開始出現(xiàn)紅斑，并伴有不同程度水腫；隨著造模時間的延長，皮膚紅斑面積逐漸變大，且水腫加重，正常對照組小鼠背部皮膚未見明顯異常。提示，ACD模型構(gòu)建成功。

ACD是由T細(xì)胞介導(dǎo)的抗原特異性過敏反應(yīng)，臨床癥狀以皮膚表面出現(xiàn)丘疹和紅斑、組織水腫以及炎性細(xì)胞浸潤為主要特征［10-11］，且極易復(fù)發(fā)，進(jìn)而形成濕疹、苔蘚和鱗屑樣病變，嚴(yán)重影響患者的生活，因此，采取有效的措施治療ACD是醫(yī)學(xué)工作者研究的重點。目前西醫(yī)治療ACD的以抗組胺類和糖皮質(zhì)激素類藥物為主，此類藥物副作用較大，且不能從根本上抑制ACD的發(fā)生、發(fā)展［12］。但中醫(yī)學(xué)對ACD的病因和病機有獨到的見解，且中醫(yī)以其安全、高效的特點逐漸受到醫(yī)學(xué)工作者的重視。本研究采用HE染色檢測針灸對ACD皮炎小鼠皮膚組織病理學(xué)變化，結(jié)果表明，正常對照組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯的變化；模型組皮膚組織間隙水腫，且炎性細(xì)胞浸潤；與模型組相比，非經(jīng)絡(luò)針刺組和咪康唑組皮膚組織沒有明顯變化，經(jīng)絡(luò)針灸組和經(jīng)絡(luò)針灸+咪康唑組皮膚組織水腫和炎性細(xì)胞浸潤情況減輕。血清中炎癥因子、皮膚腫脹程度以及臟器指數(shù)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)絡(luò)針灸組血清中IL-2、IL-4、IL-7、TNF-α的含量，皮膚腫脹程度、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，以及皮膚中TLR4、NF-κB表達(dá)水平顯著低于模型組和非經(jīng)絡(luò)針刺組；經(jīng)絡(luò)針灸+咪康唑組血清中IL-2、IL-4、IL-7、TNF-α 的含量，皮膚腫脹程度、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，以及TLR4、NF-kB表達(dá)水平顯著低于模型組和咪康唑組；經(jīng)絡(luò)針灸+咪康唑組血清中IL-2、IL-4、IL-7、TNF-α 的含量，皮膚腫脹程度、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，以及TLR4、NF-κB表達(dá)水平與經(jīng)絡(luò)針灸組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與馬天明等［5］研究結(jié)果相符。以上結(jié)果提示，針灸通過人體經(jīng)絡(luò)的治療能迅速激發(fā)機體自身的調(diào)節(jié)潛能，抑制ACD模型小鼠的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制ACD的發(fā)生發(fā)展。

針灸對ACD小鼠具有保護(hù)，但其作用機制尚未完全明確，不少研究表明，ACD的發(fā)病機制與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［13］。本研究表明，經(jīng)絡(luò)針灸組皮膚中TLR4、NF-κB表達(dá)水平顯著低于模型組和非經(jīng)絡(luò)針刺組；經(jīng)絡(luò)針灸+咪康唑組皮膚中TLR4、NF-κB表達(dá)水平顯著低于模型組和咪康唑組；經(jīng)絡(luò)針灸+咪康唑組皮膚中TLR4、NF-κB表達(dá)水平與經(jīng)絡(luò)針灸組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明經(jīng)絡(luò)針灸可能通過激活TLR4的內(nèi)源性配體，并刺激穴區(qū)不同細(xì)胞產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子和其他化學(xué)遞質(zhì)，形成多種因子協(xié)調(diào)工作網(wǎng)，共同完成炎癥修復(fù)過程。TLR4和NF-κB是參與機體免疫反應(yīng)的重要蛋白質(zhì)分子，且TLR4/NF-κB信號通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用［14-15］。Hacini等研究表明，TLR4是Toll樣受體家族重要的蛋白分子，能夠識別并結(jié)合抗原分子引發(fā)機體的免疫反應(yīng)，TLR4還能激活下游信號分子NF-κB，NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄分子，進(jìn)入細(xì)胞核之后， 促進(jìn) IL-2、IL-4、IL-7、TNF-α 等炎性因子釋放［16］。上述結(jié)果提示，針灸能夠下調(diào)ACD小鼠皮膚組織中TLR4、NF-κB表達(dá)進(jìn)而抑制信號通路的活性，從而改善ACD癥狀。

綜上所述，針灸能夠抑制ACD的發(fā)生、發(fā)展，這一作用可能通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路實現(xiàn)的，為ACD的臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)，但目前本研究對象及實驗結(jié)果僅局限于動物模型基礎(chǔ)上，若真正應(yīng)用于臨床還需要進(jìn)一步深入的研究。

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