丹芪祛風(fēng)散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

唐斌斌，杜書君，韓子軍，苑學(xué)明 ，李建勇 ，郝保華

（1.山東省聊城市陽(yáng)谷縣人民醫(yī)院，山東 聊城 252300； 2.山東省聊城市白癜風(fēng)病診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東聊城 252000； 3.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069）

丹芪祛風(fēng)散為治療白癜風(fēng)的經(jīng)驗(yàn)方。祖國(guó)醫(yī)學(xué)稱白癜風(fēng)為“白癜”“白駁風(fēng)”“白駁”“白處”等[1-2]?！吨T病源候論》指出，白癜風(fēng)由“風(fēng)邪搏于皮膚，血?dú)獠缓退病?。《醫(yī)學(xué)金鑒·外科心法》指出：“此癥自面及頸項(xiàng)，肉色忽然變白，狀類癍點(diǎn)，并不癢痛。若因循日久，甚至延及全身。由風(fēng)邪相搏于皮膚，致令氣血失和。”表明白癜風(fēng)初期階段的表現(xiàn)特點(diǎn)與風(fēng)邪有關(guān)，選方用藥上著重考慮祛風(fēng)散邪，調(diào)和氣血[3-4]。丹芪祛風(fēng)散由丹參、黃芪、白鮮皮等中藥組方，具有祛風(fēng)補(bǔ)腎、調(diào)和氣血的功效，用于治療氣血失和證引起的白癜風(fēng)效果良好，安全性好，未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)，但目前尚無(wú)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為確保其質(zhì)量穩(wěn)定和臨床有效，本研究按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑注冊(cè)管理辦法（試行）》要求，對(duì)丹芪祛風(fēng)散進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，并建立了處方中黃芪、白鮮皮的顯微鑒別方法，以及測(cè)定丹參中丹酚酸B含量的高效液相色譜法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilengt 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；WKF-30B型萬(wàn)能粉碎機(jī)組（淄博史克制藥設(shè)備制造有限公司）；WKH-24-A型熱風(fēng)循環(huán)烘箱（山東精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司）；Olympus顯微鏡（日本歐林巴斯株式會(huì)社）；BSA224S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司）。

1.2 試藥

丹酚酸B對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111562-201313）；丹芪祛風(fēng)散（聊城市白癜風(fēng)醫(yī)院制劑室，批號(hào)分別為 20160902，20160905，20160909）；甲醇和磷酸為色譜純，其他試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪、白鮮皮的顯微鑒別5111，302，6-8

取本品粉末，置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)纖維成束或散離，兩端常斷裂成須狀或較平截（黃芪）；草酸鈣簇晶多數(shù)散在或存在于薄壁組織中（白鮮皮）。結(jié)果見(jiàn)圖1。顯微特征分別與黃芪、白鮮皮藥材一致，空白樣品（缺黃芪、白鮮皮）未檢出相應(yīng)的顯微特征。

圖1 顯微鑒別特征（4×102）

2.2 丹酚酸B的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Thermo C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -0.1%磷酸溶液（20 ∶80）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。通過(guò)DAD檢測(cè)器對(duì)供試品溶液中丹酚酸B進(jìn)行全波長(zhǎng)檢測(cè)，在擬訂色譜條件下，丹酚酸B主峰與其他雜質(zhì)峰分離良好，丹酚酸B主峰的純度因子為999.92，在可接受的閾值內(nèi)；供試品溶液中丹酚酸B主峰處無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖

2.2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇-水（8∶2）溶液制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

供試品溶液：取本品粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-水（8∶2）混合溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇-水（8∶2）混合溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：取缺丹參藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別取2.2.2項(xiàng)下3種溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰。結(jié)果表明，供試品溶液和丹酚酸B對(duì)照品溶液色譜在相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，陰性無(wú)干擾，且分離度較好，表明方法專屬性良好。色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取丹酚酸B對(duì)照品，精密稱定，用甲醇 -水（8 ∶2）制成質(zhì)量濃度分別為 1，5，10，20，50，100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按擬訂色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，以質(zhì)量濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 A=25.883C+11.153，r=0.999 6（n=6）。結(jié)果表明，丹酚酸 B 對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度在1～100 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取20 μg/mL丹酚酸B對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為0.44%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液（批號(hào)為20160902），分別于 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積平均值為 848.90，RSD 為 1.52% （n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20160902）樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定。結(jié)果丹酚酸B的平均含量為1.405 mg/g，RSD為0.70%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量（批號(hào)為20160902，丹酚酸B含量為1.491 mg/g）的樣品6份，每份約0.8 g，精密稱定，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.105 5 g/L的丹酚酸 B對(duì)照品溶液各0.5 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 丹酚酸B加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取 3批樣品（批號(hào)分別為 20160902，20160905，20160909），按 2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取樣品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果 3批樣品中丹酚酸 B的含量分別為 1.426，1.618，1.380 mg/g（n=3）。

3 討論

3.1 定性鑒別

近年來(lái)，在低碳環(huán)保理念下，中醫(yī)藥研究和實(shí)際工作中顯微鑒別手段備受關(guān)注。丹芪祛風(fēng)散保留了中藥飲片的固有顯微鑒別特征，本研究中首先嘗試顯微鑒別，參照2015年版《中國(guó)藥典（一部）》和文獻(xiàn)[9-11]中各味藥材的鑒別要點(diǎn)，其中黃芪和白鮮皮的特征明顯，易于觀察，缺黃芪和白鮮皮的陰性樣品中未檢出相應(yīng)的顯微特征，其他藥材鑒別特點(diǎn)不明顯或有干擾。

對(duì)丹芪祛風(fēng)散中飲片進(jìn)行了薄層色譜鑒別，其中在蒺藜的薄層色譜鑒別中，曾用藥典方法以三氯甲烷-甲醇 -水（13：7：2）為展開(kāi)系統(tǒng)，結(jié)果斑點(diǎn)有重疊，不能完全分離，集中于色譜圖的前1/3處。參考文獻(xiàn)[12]，改用石油醚（60～90℃ ）-乙酸乙酯 -甲酸（20 ∶1 ∶1）、正己烷-氯仿-乙酸乙酯[13]為展開(kāi)系統(tǒng)，也不能有效分離。方中黃芪按藥典方法以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）為展開(kāi)系統(tǒng)，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，日光下顯相同棕褐色斑點(diǎn)，紫外光燈（365 nm）下顯不同顏色的斑點(diǎn)。因顯微鑒別項(xiàng)已鑒別了黃芪，出于節(jié)約檢測(cè)成本和時(shí)限考慮，未進(jìn)一步研究黃芪的薄層鑒別。

3.2 定量鑒別

建立高相液相色譜法時(shí)，考察了丹酚酸B的流動(dòng)相乙腈 -0.1% 磷酸溶液（22 ∶78）[5]77、甲醇 -乙腈 -0.5% 甲酸（22 ∶10 ∶68）[14]和甲醇 -乙腈 -1% 冰醋酸水溶液（27 ∶13 ∶60）[15]，多次試驗(yàn)后，適當(dāng)調(diào)整，以乙腈-0.1%磷酸溶液（20∶80）為流動(dòng)相，以流速為1.0 mL/min時(shí)，分離效果好，能消除丹酚酸B色譜峰前面的肩峰干擾，故選擇列入標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，本研究中確立了丹芪祛風(fēng)散中黃芪和白鮮皮的顯微鑒別方法和丹參中丹酚酸B的含量測(cè)定方法，試驗(yàn)表明該方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，可作為丹芪祛風(fēng)散的質(zhì)量控制方法。

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