川芎促血管舒張有效部位中阿魏酸的含量測(cè)定

陳志民 ，劉建清 ，郭瑩瑩 ，林 紅 ，謝奇恩 ，甘惠貞 ，王佳坤 △

（1.中國(guó)人民解放軍第180醫(yī)院，福建 泉州 362000； 2.南京軍區(qū)聯(lián)勤部機(jī)關(guān)幼兒園保健室，江蘇 南京 210001）

川芎為傘型科植物川芎的干燥根莖，臨床主要用于治療胸痹心痛、胸肋刺痛、跌打腫痛、月經(jīng)不調(diào)等疾病，因此對(duì)其藥理作用、質(zhì)量鑒定及含量測(cè)定的研究都對(duì)川芎的臨床實(shí)際應(yīng)用意義重大[1]。關(guān)于川芎有效成分的含量測(cè)定主要有氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）[2-8]等方法。報(bào)道較多的是HPLC和GC-MS法，這2種方法雖然定量比較準(zhǔn)確，但需要有純度較高、穩(wěn)定性較好的對(duì)照品，且在分離較好的情況下才能進(jìn)行定量測(cè)定。武亞曉等[9]對(duì)阿魏酸的提取工藝及測(cè)定方法進(jìn)行了改進(jìn)，為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)川芎的化學(xué)成分及藥理作用研究較多，但關(guān)于活性部位的質(zhì)量控制研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)中首次采用HPLC法測(cè)定具有促血管舒張作用的川芎大孔吸附樹(shù)脂洗脫物中阿魏酸的含量，為更深入地研究川芎及其相關(guān)質(zhì)量控制提供了參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200LC型高效液相色譜儀，G1311A型四元泵，G1365B/D型紫外檢測(cè)器，Angilent Chemstation色譜工作站（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；電子天平（萬(wàn)分之一，賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（超聲頻率為40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（轉(zhuǎn)速為20～280 r/min，上海申勝生物技術(shù)有限公司）；超純水系統(tǒng)（Sartorius Ag Germany arium 611UF S/N：21710655）；AB-8 大孔吸附樹(shù)脂（天津南開(kāi)大學(xué)化工廠）。

1.2 試藥

阿魏酸化學(xué)對(duì)照品（批號(hào)為0773-9910，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇（Product of Dikma Technologies，色譜純）；川芎飲片購(gòu)自哈爾濱市三棵樹(shù)藥材，經(jīng)中國(guó)人民解放軍第180醫(yī)院中醫(yī)科李樹(shù)清主任醫(yī)師鑒定為正品；冰乙酸（批號(hào)為 1504231）、乙酸乙酯（批號(hào)為1607011）、乙醇（批號(hào)為 15102602）等均為分析純，購(gòu)于西隴化工股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 川芎有效部分的提取流程

提取流程見(jiàn)圖1。

圖1 川芎離體血管舒張有效部位提取流程

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：冰乙酸（濃度為 0.099 5% ）- 甲醇（65∶35）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：322nm；柱溫：20℃；進(jìn)樣量：10μL。分別進(jìn)樣阿魏酸對(duì)照品溶液和川芎供試品溶液各10μL，在此色譜條件下的色譜圖見(jiàn)圖2，理論板數(shù)[n=5.54（tR/W1/2）2]按阿魏酸峰計(jì)算應(yīng)不低于 4000。

2.2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取阿魏酸化學(xué)對(duì)照品6.3 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶，用甲醇溶解，定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.63 g/L的溶液，作為對(duì)照品貯備液A。分別精密吸取對(duì)照品貯備液 4.0，3.0，2.0，1.0 mL 置 5 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，即得不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，記為 B，C，D，E。

供試品溶液：取川芎-60%醇提取部位樣品0.4997g，置錐形瓶中，精密稱定，加入超純水15 mL，超聲20 min，完全溶解，分別用乙酸乙酯（20，20，10mL）萃取 3 次，合并萃取液，揮干提取溶劑，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并定容至10 mL，搖勻，用移液管精密移取1 mL置10mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，作為供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：按擬訂色譜條件，精密吸取對(duì)照品溶液 A，B，C，D，E 各 10 μL 進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（C）作線性回歸，得阿魏酸線性回歸方程 A=3.065 ×104C+99.504（r=0.999 87）。結(jié)果表明，阿魏酸進(jìn)樣量在 1.26 ～6.30 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一質(zhì)量濃度阿魏酸對(duì)照品溶液（溶液 E），在擬訂色譜條件下進(jìn)樣 10 μL，重復(fù) 5次，測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0.27%（n=5），表明儀器精密度良好。

圖2 高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為170608）適量，依法制備供試品溶液，于 0，2，4，8，24 h 時(shí)在擬訂色譜條件下分別測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0.22%（n=5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為170608）適量，依法制備供試品溶液，共5份，在擬訂色譜條件下依法測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0.08%（n=5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取己知含量的同一樣品5份，精密稱定 0.025 g（相當(dāng)于阿魏酸 0.743 mg），分別加入一定量的阿魏酸對(duì)照品，依法測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 阿魏酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取川芎樣品3份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中阿魏酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 川芎中阿魏酸含量測(cè)定結(jié)果（%，n=3）

3 討論

在對(duì)流動(dòng)相組成及檢測(cè)器波長(zhǎng)的選擇中，分別以甲醇 - 冰乙酸（體積分?jǐn)?shù)為 0.099 5%）為 30 ∶70，35 ∶65，40 ∶60 進(jìn)行試驗(yàn)，并記錄了 230，278，313，322 nm 4 個(gè)波長(zhǎng)的色譜圖。結(jié)果表明，用甲醇-冰乙酸（35∶65）作為流動(dòng)相，波長(zhǎng)為322 nm的色譜條件為最佳。在此色譜條件下，川芎有效部位的供試品溶液可檢出4個(gè)主要色譜峰，且保留時(shí)間跨度較大，分離效果較好。

在供試品制備時(shí)發(fā)現(xiàn)，阿魏酸對(duì)熱乙酸乙酯有較好溶解度，故采用乙酸乙酯對(duì)樣品進(jìn)行萃取處理[10-12]，結(jié)果得到了驗(yàn)證，該有效部位中的阿魏酸平均含量達(dá)2.97%，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)[5]報(bào)道的川芎藥材中阿魏酸0.075% ～0.14%的含量。同時(shí)對(duì)阿魏酸的提取時(shí)間進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取時(shí)間大于1h，或提取次數(shù)大于2次時(shí)，阿魏酸的提取量并未明顯增加。綜合考慮時(shí)間-成本關(guān)系，最后阿魏酸的提取條件定為乙酸乙酯提取2次，每次1 h。

阿魏酸有順式和反式兩種立體結(jié)構(gòu)，原藥材和制劑中阿魏酸以反式結(jié)構(gòu)存在，但隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，反式阿魏酸會(huì)慢慢轉(zhuǎn)化為順式結(jié)構(gòu)。文獻(xiàn)[6]報(bào)道了阿魏酸的穩(wěn)定性問(wèn)題，在48 h內(nèi)，僅有約1%的反式阿魏酸轉(zhuǎn)化為順式阿魏酸，對(duì)定量分析而言，在測(cè)定誤差允許范圍內(nèi)。為保證阿魏酸的穩(wěn)定性和對(duì)川芎質(zhì)量控制的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)中考察了對(duì)照品和供試樣品在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性，并保證對(duì)照品與供試品在該時(shí)間內(nèi)使用，保證了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

阿魏酸作為川芎的有效成分，常用于藥材及其制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)。這主要是因?yàn)榘⑽核峋哂锌寡“迥?、抑?-羥色胺從血小板中釋放、阻止靜脈旁路血栓形成、抗動(dòng)脈粥樣硬化、清除自由基等作用[13-17]。今后的試驗(yàn)中，將在提取阿魏酸的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開(kāi)展藥效學(xué)研究，如抗心肌缺血和抗腦缺血試驗(yàn)，以期得到完善的藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果。

傳統(tǒng)中藥材是在傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下使用，有著幾千年的用藥經(jīng)驗(yàn)，其療效確切、可靠，特別是經(jīng)典處方，在某些特定疾病中發(fā)揮著重要作用，但中藥材有其自身不足，如在臨床應(yīng)用中存在著成分不明，易引起不良反應(yīng)，且需要較大劑量的問(wèn)題。本試驗(yàn)中提取藥材的單一有效成分阿魏酸有助于后期藥效學(xué)的研究，且提取后的阿魏酸臨床應(yīng)用更方便，可相對(duì)克服以上中藥材存在的不足。

[1]張翠英，章 洪，戚瓊?cè)A.川芎的有效成分及藥理研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)雜志，2014，41（10）：2264-2266.

[2]盧 歡，唐曉丹，李 博.超聲輔助萃取川芎中阿魏酸工藝的優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55（9）：2235-2238.

[3]何書(shū)連.HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地川芎中阿魏酸的含量[J].黑龍江醫(yī)藥，2014，27（1）：20-22.

[4]李新貴.高效液相色譜測(cè)定川芎配方顆粒中阿魏酸的含量[J].兒科藥學(xué)雜志，2017，23（6）：49-51.

[5]呂 維，吳 戀，葉 娜，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定川芎藥材中阿魏酸和藁本內(nèi)酯的含量[J].中藥與臨床，2014，5（2）：13-15.

[6]蘇秀蘭，楊倚麟.薄層析-紫外分光光度法測(cè)定川芎中阿魏酸含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（7）：142-144.

[7]楊 麗，胡昌江，周 維，等.川芎配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥業(yè)，2012，21（10）：28-29.

[8]王 虎，李文兵，胡昌江，等.不同產(chǎn)地川芎主要有效成分含量比較[J].中國(guó)藥業(yè)，2015，24（21）：37-39.

[9]武亞曉，李 希，馮建安，等.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化川芎阿魏酸的提取工藝[J].中藥與臨床，2015，6（3）：22-25.

[10]李艷清，周良芹，王 蓉，等.川芎中阿魏酸和川芎嗪的提取及檢測(cè)方法研究[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版 ），2016，39（1）：55-59.

[11]章 洪，李振國(guó)，張翠英.川芎中阿魏酸類(lèi)效應(yīng)組分的提取純化工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（17）：5410-5415.

[12]陳倩潔，孫 明，梁瑞雪，等.煎煮時(shí)間對(duì)川芎中阿魏酸穩(wěn)定性影響的研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2002，13（4）：249-250.

[13]張錦霞，杜曉霞，曹鳳秋，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定川芎藥材中阿魏酸、咖啡酸的含量 [J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2014，4（21）：102-104.

[14]丁明玉，馬帥武，劉德麟.阿魏酸的穩(wěn)定性及其在川芎和當(dāng)歸藥材中的存在形式[J].中草藥，2004，35（1）：28-30.

[15]遲雪潔，孫 蓉.川芎基于功效物質(zhì)基礎(chǔ)的抗腦缺血藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥物警戒，2013，10（6）：355-357.

[16]楊 珍，周惠芬，周 鵬，等.川芎、黃芪有效成分配伍對(duì)缺氧腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響 [J].中草藥，2015，46（9）：1326-1332.

[17]劉 旭，程艷芹，崔曉博，等.中藥川芎心肌缺血保護(hù)作用的譜效學(xué)研究[J].中國(guó)藥業(yè)，2016，25（15）：9-12.