高效液相色譜法測(cè)定人血清萬(wàn)古霉素濃度

李 容

（重慶市涪陵中心醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 408000）

萬(wàn)古霉素是有抗生素后效應(yīng)的時(shí)間依耐性抗菌藥物，抗感染治療成敗與其血藥谷濃度密切相關(guān)，血藥谷濃度應(yīng)控制在10～20 mg/L，至少要保持在10 mg/L以上，以避免發(fā)生耐藥[1]。萬(wàn)古霉素的用藥人群包括新生兒、嬰幼兒、老年人、腎功能不全及長(zhǎng)期應(yīng)用萬(wàn)古霉素的患者等特殊人群，應(yīng)用時(shí)必須嚴(yán)格調(diào)整劑量，并進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)。本研究中用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定人血清中萬(wàn)古霉素濃度，不僅可以為臨床萬(wàn)古霉素的血藥濃度監(jiān)測(cè)提供試驗(yàn)手段，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)，還可為患者制訂個(gè)體化給藥方案，減少用藥后的不良反應(yīng)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)人血清中萬(wàn)古霉素的濃度監(jiān)測(cè)方法有6類(lèi)，即微生物檢測(cè)法[2]、酶放大免疫法（EMIT）[3]、熒光偏振免疫法（FPIA）[4]、液相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）[5]、離子對(duì)色譜法[6]、高效液相色譜法。由于微生物檢測(cè)法耗時(shí)較長(zhǎng)且精密度低，EMIT和FPIA的專(zhuān)屬性較差，LC-MS/MS法儀器價(jià)格昂貴致前期投入較大，而高效液相色譜法具有提取率高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，因此，我院亦采用HPLC法測(cè)定萬(wàn)古霉素的血藥濃度。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV-2401PC型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；高精度電子天平（上海光正醫(yī)療儀器股份有限公司）；pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；TG16W型醫(yī)用高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙平凡儀器儀表股份有限公司）；TD4B型醫(yī)用離心機(jī)（長(zhǎng)沙平凡儀器儀表股份有限公司）。

1.2 試藥

萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度為 99%，批號(hào)為 130360-201302）；甲醇（批號(hào)為20160601），乙腈（批號(hào)為 20151111），均為色譜純，由美國(guó)Burdick&Jackson公司提供；磷酸二氫鉀（批號(hào)為2016042801），三氯乙酸（批號(hào)為 2016073101），均為分析純，由成都市科龍化工試劑廠提供；磷酸（分析純，重慶川東化工集團(tuán)有限公司，批號(hào)為20160509）；試驗(yàn)用水為本院自制重蒸餾水，空白血清為本院檢驗(yàn)科采集。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：VP-ODSC18柱（150mm×4.6mm，4.6μm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L 磷酸二氫鉀緩沖溶液（pH=3.2）-甲醇（83∶17）；流速：1mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：205nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 溶液配制

流動(dòng)相配制：取磷酸二氫鉀6.805 g，精密稱(chēng)定，置1000mL燒杯中，用1000mL蒸餾水溶解，攪拌均勻，用磷酸調(diào)節(jié)溶液的pH，緩慢滴加，邊滴加邊用玻璃棒攪勻，直至溶液的pH達(dá)3.2，即配制成0.05mol/L的磷酸二氫鉀緩沖溶液（pH=3.2），置陰涼處保存，備用。

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：取0.045 0 g萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容，搖勻，即配制成質(zhì)量濃度為980 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，于冰箱中4℃冷藏，備用，使用時(shí)稀釋為所需質(zhì)量濃度。

蛋白沉淀劑：稱(chēng)取三氯乙酸10 g，用純化水溶解至100 mL，搖勻，即得10%三氯乙酸溶液，用微量移液器分別移取1 200 μL 10%三氯乙酸溶液和300 μL乙腈置EP管中，震蕩搖勻，置陰涼處保存，備用。

2.3 血清樣品預(yù)處理

抽取使用過(guò)萬(wàn)古霉素患者的靜脈血約3 mL，置普通抽血管中，以2 500 r/min的速率離心5 min，取上層血清樣品 200 μL，置 2.0 mL EP 管中，再加入 150 mL蛋白沉淀劑[10% 三氯乙酸 -乙腈（1 200 μL ∶300 μL）]，以12 000 r/min的速率離心15 min，取上清液 20 μL進(jìn)樣。

2.4 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：在選定的樣品處理方法和色譜分離條件下，測(cè)定空白血清、空白血清加標(biāo)準(zhǔn)品及血清樣品的色譜峰。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，血清中干擾物質(zhì)峰主要出現(xiàn)在12.5 min前，故把萬(wàn)古霉素的保留時(shí)間（tR）控制在14 min左右，萬(wàn)古霉素與血清中的干擾物質(zhì)能得到良好分離，同時(shí)分離時(shí)間也不太長(zhǎng)，保證了實(shí)驗(yàn)時(shí)間的合理性和可控制性。色譜圖見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察：用微量移液管分別取10，20，40，60，80，100，120 μL 萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置 2.0 mL EP管中，分別加入純化水 190，180，160，140，120，100，80 μL，振蕩 3 min，搖勻；取上述溶液各 20 μL 置另一系列EP管中，各加入180 μL空白血清，振蕩3 min搖勻，配置成質(zhì)量濃度分別為 4.90，9.80，19.60，29.40，39.20，49.00，58.80 μg/mL 的溶液；再各加入 150 μL蛋白沉淀劑，振蕩3 min，搖勻；最后置離心機(jī)中，以12 000 r/min的速率離心15 min，取出；按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=26 385X-19 207，r=0.999 6（n=7）。結(jié)果表明，血清質(zhì)量濃度在 4.90 ～58.80 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；最低檢測(cè)限為 1.96 μg/mL（n=7）。

精密度試驗(yàn)：取適量萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液加至180 μL空白血清中，分別配制成質(zhì)量濃度為 9.80，19.60，29.40，39.20 mg/L 的血清樣品溶液，按專(zhuān)屬性試驗(yàn)方法處理樣品，吸取上清液20 μL直接進(jìn)樣，1 d內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，每次分析17 min，連續(xù)測(cè)定5 d。結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)該方法的日內(nèi)、日間 RSD均低于4%（n=5）。

絕對(duì)回收率試驗(yàn)：精密吸取萬(wàn)古霉素對(duì)照品貯備液，配制質(zhì)量濃度為 9.80，19.60，29.40 mg/L 的萬(wàn)古霉素血清樣品，按2.2項(xiàng)下方法處理樣品，每一質(zhì)量濃度平行操作5份，取20 μL進(jìn)樣，將儀器檢測(cè)到的質(zhì)量濃度與實(shí)際配制質(zhì)量濃度相比得方法回收率，詳見(jiàn)表2。

圖1 高效液相色譜圖

表1 日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

表2 絕對(duì)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：制備 4.9，39.2，58.8 μg/mL 低、中、高3種質(zhì)量濃度萬(wàn)古霉素血清樣品各3份，于冰箱冷藏室（2～8℃）冷藏 1，2，4 d，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表 3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.5 臨床應(yīng)用

2.5.1 病例分析

患者，男，50歲，體質(zhì)量60 kg，因糖尿病伴多種并發(fā)癥及肺部感染，于2017年1月23日入住重癥監(jiān)護(hù)室（ICU），入院后立即給予心電監(jiān)護(hù)、吸氧、保留導(dǎo)尿、建立靜脈通道、行床旁心電圖。微生物檢查報(bào)告導(dǎo)管血及導(dǎo)管尖端培養(yǎng)均有表皮葡萄球菌感染，痰培養(yǎng)提示有肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌感染。結(jié)合患者病情考慮為導(dǎo)管相關(guān)膿毒血癥，給予萬(wàn)古霉素、氟康唑、哌拉西林他唑巴坦等抗生素進(jìn)行抗感染治療。在使用萬(wàn)古霉素前，患者的血清肌酐為417.7 μmol/L，肌酐清除率為 15.80 mL/min，醫(yī)師給予“萬(wàn)古霉素 1 g，q12 h”靜脈微泵輸入，連用3 d后于再次給藥前取患者血清，送檢，用HPLC法測(cè)定萬(wàn)古霉素的血藥濃度，測(cè)定值為48.71 μg/mL（重癥患者參考值為 15 ～20 μg/mL），醫(yī)師調(diào)整給藥方式為“0.5 g，biw，ivgtt”，24 h 后測(cè)定患者的血肌酐為 686.1 μmol/L，肌酐清除率為 9.62 mL/min，仍持續(xù)使用萬(wàn)古霉素等抗生素1周后，靜脈導(dǎo)管尖端培養(yǎng)未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，患者病情好轉(zhuǎn)，一般情況尚可，腎功能損害較大，轉(zhuǎn)出ICU，轉(zhuǎn)入腎內(nèi)科病房繼續(xù)治療。

表4 FPIA法與HPLC法測(cè)定萬(wàn)古霉素標(biāo)本的結(jié)果

2.5.2 FPIA法與HPLC法測(cè)定結(jié)果比較

標(biāo)本來(lái)源為重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院。利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，分析結(jié)果認(rèn)為，兩總體的方差無(wú)顯著差異。說(shuō)明我院用HPLC法與重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院FPIA法2種方法測(cè)定人血清中萬(wàn)古霉素的濃度的結(jié)果無(wú)顯著性差異，表明我院建立的HPLC法測(cè)定萬(wàn)古霉素血藥濃度方法可行。詳見(jiàn)表4。

2.5.3 我院臨床標(biāo)本的測(cè)定

2016年11月至2017年3月，我科為ICU監(jiān)測(cè)萬(wàn)古霉素血藥濃度5次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 我院臨床ICU標(biāo)本萬(wàn)古霉素測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

將質(zhì)量濃度為10 mg/L的萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以水作為空白對(duì)照在UV-2401PC型紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行掃描。結(jié)果，萬(wàn)古霉素在280 nm波長(zhǎng)處有最大吸光度，有末端吸收；高效液相色譜法試驗(yàn)表明，280 nm處的吸收峰面積為205 nm波長(zhǎng)處的吸收峰面積的1/7，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm。

3.2 流動(dòng)相選擇

曾考察了流動(dòng)相系統(tǒng)中兩種成分的不同比例對(duì)有效成分分離的影響，甲醇 -0.05 mol/L 磷酸二氫鉀緩沖液（pH=2）的比例分別為16∶84和17∶83，等度洗脫。結(jié)果表明，兩種流動(dòng)相系統(tǒng)都能使萬(wàn)古霉素與雜質(zhì)峰分開(kāi)，但當(dāng)甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH=3.2）的比例為17∶83時(shí)萬(wàn)古霉素有較好的分離，分離度為 1.900，拖尾因子為 1.052，tR為 14 min，故最終選擇后者（17∶83）為流動(dòng)相。

3.3 蛋白沉淀劑優(yōu)化

選擇4種蛋白沉淀劑考察沉淀蛋白的效果，分別為10%硫酸鋅溶液、10%三氯醋酸溶液、10%高氯酸沉淀蛋白二氯甲烷萃取、10%三氯乙酸和乙腈（4∶1）。結(jié)果顯示，10%硫酸鋅溶液沉淀蛋白不完全，離心后上清液渾濁無(wú)法直接進(jìn)樣；10%三氯乙酸沉淀蛋白二氯甲烷萃取，處理血樣時(shí)操作煩瑣，二氯甲烷萃取離心后水層不宜吸出；10%三氯乙酸溶液沉淀蛋白，離心后上清液澄清，但提取率只有33%，10%高氯酸和乙腈（4∶1）沉淀蛋白，離心后上清液澄清，提取率可達(dá)70%，所以最終選擇10%三氯乙酸和乙腈（4∶1）作為血清蛋白沉淀劑。

3.4 研究?jī)r(jià)值

耳、腎毒性是萬(wàn)古霉素最嚴(yán)重的不良反應(yīng)，其發(fā)生與血藥濃度過(guò)高有關(guān)，臨床應(yīng)用時(shí)常通過(guò)監(jiān)測(cè)血藥濃度來(lái)降低耳、腎功能損害風(fēng)險(xiǎn)。HPLC法提取率高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便、靈敏，適用于臨床患者使用萬(wàn)古霉素后的血藥濃度測(cè)定。本研究使為患者進(jìn)行個(gè)體化給藥、優(yōu)化給藥方案和提高臨床療效成為可能。

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