連翹根際高效解有機(jī)磷細(xì)菌的篩選鑒定及促生長特性研究

吳 偉 張鵬飛 張桂萍 李秀芳 任嘉紅

(1. 山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041000；2. 長治學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，山西 長治 046011)

連翹 (Forsythiasuspensa) 隸屬木樨科連翹屬，是我國華北地區(qū)常見的抗旱和觀賞植物，具有良好的經(jīng)濟(jì)發(fā)展前景；另外連翹具清熱解毒、消腫散結(jié)等功效，已被我國藥典收藏并作為常用傳統(tǒng)中藥之一[1]。連翹在種植過程存在大量施用化肥的情況，這不僅提高了生產(chǎn)成本，還容易造成土壤板結(jié)、土壤功能退化以及微生態(tài)失調(diào)等問題，阻礙了土壤的可持續(xù)利用，而且化學(xué)肥料的大量使用也為以連翹作為原材料的藥品安全帶來了巨大隱患[2]。因此，有必要探尋其他更為安全可持續(xù)的微生物菌劑以部分替代化肥，實現(xiàn)連翹品質(zhì)和產(chǎn)量優(yōu)化生產(chǎn)并促進(jìn)我國連翹種植業(yè)發(fā)展。

植物根際促生菌 (PGPR) 是一類能夠定殖于植物根部系統(tǒng)并能直接或間接促進(jìn)植物生長發(fā)育的有益微生物，目前已報道的促生菌主要有解磷菌、固氮菌、解鉀菌等[3]。其中解磷菌可以將土壤中植物難以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)，根據(jù)分解底物的不同又可將解磷菌分為溶無機(jī)磷微生物 (PSB) 和解有機(jī)磷微生物 (OPB)[3]。解磷菌不僅在活化土壤養(yǎng)分，提高土壤中磷含量和促進(jìn)植物生長發(fā)育等方面起著重要作用，而且還可以通過產(chǎn)生誘導(dǎo)植物生長的生長激素、赤霉素和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸 (ACC) 脫氨酶等活性物質(zhì)來間接促進(jìn)植物生長發(fā)育[4]。如黃靜等[5]從油菜 (Oryzasativa) 根際土壤分離出的解磷細(xì)菌均具有產(chǎn)吲哚乙酸和嗜鐵素的能力；譚石勇等[6]從苧麻(Boehmerianivea)根際土壤篩選出的4株解磷細(xì)菌具有產(chǎn)IAA、嗜鐵素和固氮能力，且均能促進(jìn)苧麻種子的萌發(fā)和植株的生長。目前有研究報道在丹參 (Salviamiltiorrhiza)、當(dāng)歸 (Angelicasinensis) 和地黃 (Rehmanniaglutinosa)[7-8]等藥用植物根際分離獲得很多PGPR菌株，對其解磷、固氮、解鉀、產(chǎn)生生長激素和抑病機(jī)理等方面進(jìn)行了有益的探索。但是目前對于連翹的研究多集中在其藥用成分包括連翹苷和連翹脂苷等方面，而對其根際PGPR的研究卻鮮有報道。

本研究以長治地區(qū)的連翹根際土壤為研究對象，擬通過分離篩選出具有多種促生性能的解有機(jī)磷細(xì)菌 (OPB)，為藥用植物連翹專用微生物肥料的研制和生產(chǎn)提供菌種資源，并為植物-促生菌互作的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1土樣采集

選擇山西省長治市連翹分布區(qū) (35°68′93.53″ N，113°44′89.9″ E) 作為采樣區(qū)，共5個采樣點。每個點隨機(jī)選取3株長勢較好的連翹，去掉地表枯枝落葉層，用無菌小鏟挖取0～15 cm處的連翹根際土壤裝入塑料袋中，低溫通風(fēng)保存帶回實驗室放于4 ℃冰箱中，隨即進(jìn)行細(xì)菌的分離。

1.1.2培養(yǎng)基

LB (Luria Bertani) 培養(yǎng)基[9]，蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基[10]，King′s B培養(yǎng)基[11]，CAS培養(yǎng)基[12]，TSB、DF和ADF培養(yǎng)基[13]，Ashby無氮培養(yǎng)基[14]。

1.2 菌株的分離與篩選

采用稀釋涂布平板法進(jìn)行解有機(jī)磷細(xì)菌的分離。分別取濃度為10-3、10-4和10-5的土壤稀釋液均勻涂布于蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基平板中，各稀釋度設(shè)3個重復(fù)，置于28 ℃下培養(yǎng)3～4 d。待菌體長出后挑取生長量大、菌落四周含透明圈的菌株，純化3次以上至獲得純培養(yǎng)，挑取單菌落至斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d后，4 ℃條件下保存，備用。

1.3 測定方法

1.3.1解磷活性的測定

定性測定：將分離獲得的純菌株分別點接種于蒙金娜固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)7 d，根據(jù)解磷圈直徑 (D) 與菌落直徑 (d) 比值大小初步確定其解磷能力。

定量測定：將待測菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 180 r/min培養(yǎng)24 h，10 000 r/min離心1 min后去上清液，用無菌水重懸菌體沉淀。實驗組取1 mL菌懸液接種于50 mL蒙金娜液體培養(yǎng)基中，對照組在蒙金娜液體培養(yǎng)基中接種1 mL滅菌菌懸液，每個處理設(shè)3個重復(fù)，同時于30 ℃ 180 r/min條件下培養(yǎng)1～7 d。從第1天開始，每天定時取上述菌懸液經(jīng)4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，取上清，使用鉬銻抗比色法[15]測定上清液中可溶性磷含量。待測菌株解磷量即為實驗組和對照組可溶性磷含量的差值。

1.3.2菌株其他促生特性測定

1) 產(chǎn)IAA能力測定。Salkowski法測定菌株生長素分泌能力[16]。定性檢測：以加入比色液后室溫靜置15 min顏色變化為判斷依據(jù)，確定菌株是否具有分泌IAA的能力。定量檢測：菌懸液離心后所得的上清液加二倍體積的比色液，室溫暗處顯色30 min后，于530 nm處測定OD值，參照生長素標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測菌株的生長素產(chǎn)生量。

2) 產(chǎn)嗜鐵素能力測定。待測菌株點接種于CAS培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，如菌株周邊有黃綠色暈圈產(chǎn)生就可以證明該菌株具產(chǎn)嗜鐵素能力[12]。

3) 產(chǎn)NH3能力測定。待測菌株接種到10 mL 10 g/L蛋白胨溶液試管，28 ℃ 200 r/min培養(yǎng)2～3 d，每管加0.5 mL Nessler′s試劑，若出現(xiàn)黃褐色沉淀則證明該菌株為產(chǎn)NH3陽性反應(yīng)[17]。

4) 產(chǎn)HCN能力測定。待測菌株劃線于含4.4 g/L甘氨酸的LB固體培養(yǎng)基上，同時在培養(yǎng)基上平鋪浸有2%的Na2CO3和0.5%的2, 4, 6-三硝基苯酚溶液的濾紙并密封，28 ℃培養(yǎng)4 d，若濾紙由橘黃色變?yōu)榧t色則證明有HCN產(chǎn)生[17]。

5) ACC脫氨酶活性定性測定。將待測菌株接入50 mL Ashby無氮液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；吸取100 μL 菌懸液接種至50 mL DF培養(yǎng)基同條件下培養(yǎng)24 h；按2%接種量轉(zhuǎn)接入50 mL ADF培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。能以ACC為唯一氮源生長的菌株為ACC脫氨酶陽性菌株[13]。

6) 固氮能力測定。定性檢測：待測菌株劃線于Ashby無氮固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，若菌株能正常生長，則說明該菌株具有固氮能力[14]。定量檢測：將待測菌株接種于含有5 mL無氮培養(yǎng)基的頂空瓶中，在30 ℃恒溫條件下密封培養(yǎng)24 h后，用無菌注射器抽取2 mL氣體，再注入等體積乙炔，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，抽取0.5 mL氣體進(jìn)入氣相色譜儀分析乙烯含量，即為固氮酶活性 (C2H4, μL)=還原乙烯量 (C2H4, μL)/d。

1.3.3菌株的鑒定

按照 《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》 對菌株的形態(tài)特征與生理生化進(jìn)行分析[18]，每個處理設(shè)3個重復(fù)；利用GenⅢ Microstation鑒定系統(tǒng)進(jìn)行Biolog鑒定；16S rDNA序列分析：提取細(xì)菌的基因組DNA后，采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物 (正向引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；反向引物1512R：ACGGCTACCTTGTTACGACT) 對篩選菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后送到Invitrogen公司測序。將得到的基因序列分別登陸EzTaxon server (http://www.EzTaxon.org)和NCBI進(jìn)行BLAST，選取數(shù)據(jù)庫中有代表性的菌株16S rDNA，采用Bioedit軟件的Multiple Sequence Alignment程序進(jìn)行分析，并利用軟件MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 (Bootstrap=1 000)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及制圖，應(yīng)用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選

利用蒙金娜選擇培養(yǎng)基從長治市5個采樣點的連翹根際土壤中共分離出16株不同形態(tài)特征的解磷菌，其中挑取9株生長速度快，在培養(yǎng)基上具有較大解磷圈的菌株 (表1)，部分菌株產(chǎn)生的解磷圈見圖1。各菌株D/d值在1.01～1.38之間，D/d值最大的菌株為LQYJ6 (1.38)，其余依次為LQYJ1 > LQYJ9 > LQYJ3 > LQYJ4 > LQYJ5 > LQYJ2 > LQYJ8 > LQYJ7。通過定量測定所分離菌株解磷量發(fā)現(xiàn)供試的9株菌解磷量在1.07～52.45 mg/L之間，各菌株解磷能力差異顯著 (P< 0.05)，其中解磷量最大的菌株是LQYJ6 (52.45 mg/L)，其余依次為LQYJ1 > LQYJ9 > LQYJ3 > LQYJ4 > LQYJ5 > LQYJ7 > LQYJ2，解磷量最小的菌株是LQYJ8 (1.07 mg/L)。

表1 菌株解有機(jī)磷能力測定Table1 Organic phosphate-mineralizing ability of strains

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示對照與處理間在0.05水平存在顯著性差異。

2.2 菌株的其他促生長特性

對篩選獲得的9株解有機(jī)磷細(xì)菌產(chǎn)IAA、產(chǎn)HCN、產(chǎn)NH3、分泌嗜鐵素、固氮以及是否具有產(chǎn)ACC脫氨酶活性等多種促生長特性進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。這9株菌均具有產(chǎn)IAA和嗜鐵素的能力，但不同菌株產(chǎn)IAA能力有所不同，含量在6.71～0.17 μg/mL之間，其中產(chǎn)IAA能力最強(qiáng)的菌株為LQYJ6 (6.71 μg/mL)，最弱的菌株是LQYJ2 (0.17 μg/mL)；部分菌株在CAS平板上產(chǎn)嗜鐵素圈的能力見圖2。

圖1部分代表菌株產(chǎn)生的解磷圈
Fig.1 Organic phosphate-mineralizing zone produced by some representative strains

表2 菌株其他促生能力測定Table 2 Other growth promoting characteristics of strains

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示對照與處理間在0.05水平存在顯著性差異；“+”代表不同菌株促生能力等級，反之為“-”。

圖2部分菌株產(chǎn)嗜鐵素能力測定
Fig.2 The ability to secret siderophore of some strains

菌株LQYJ3和LQYJ8具有產(chǎn)NH3能力；菌株LQYJ3和LQYJ4具有產(chǎn)HCN能力；菌株LQYJ2和LQYJ5具有固氮能力；固氮酶活性分別為0.13 μL/d和0.15 μL/d；另外，除了LQYJ1、LQYJ2、LQYJ3、LQYJ4、LQYJ5和LQYJ9菌株外，其余3個菌株均具有ACC脫氨酶活性。綜合9株解有機(jī)磷細(xì)菌的不同解磷能力，可以看出除了菌株LQYJ1以外，這9株解磷細(xì)菌分別具有2種或2種以上的促生特性，例如菌株LQYJ6同時具有解有機(jī)磷、產(chǎn)IAA和ACC脫氨酶活性；菌株LQYJ3同時具有解有機(jī)磷、產(chǎn)NH3和產(chǎn)HCN能力；菌株LQYJ5具有解有機(jī)磷、固氮和產(chǎn)IAA能力；以及菌株LQYJ8具有解有機(jī)磷、ACC脫氨酶活性和產(chǎn)NH3能力。因此，可以根據(jù)不同需求將上述促生菌制成微生物菌劑應(yīng)用到連翹的種植產(chǎn)業(yè)中。以上結(jié)果表明，從連翹根際分離到9株解磷細(xì)菌具有多種促生長特性，這為將來利用菌株促進(jìn)植物的生長提供參考依據(jù)。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1形態(tài)與生理生化特征

從連翹根際篩選出的9株解有機(jī)磷細(xì)菌的形態(tài)、生理生化特征見表3～4。由表3～4可以看出，除了菌株LQYJ8為革蘭氏陽性 (G+) 菌、產(chǎn)芽孢外，其余菌株均為革蘭氏陰性 (G-) 菌、不產(chǎn)芽孢。除了菌株LQYJ5為兼性厭氧菌外，其余菌株均為好氧菌。菌株LQYJ8菌落邊緣呈鋸齒狀且菌體干燥，具芽孢，可初步鑒定其屬于芽孢桿菌屬，菌株LQYJ1、LQYJ3、LQYJ4、LQYJ6和LQYJ7的形態(tài)和生理生化特征總體相近。

表3 解有機(jī)磷細(xì)菌的形態(tài)特征Table 3 Morphology characteristics of organic phosphate-mineralizing strains

表4 解有機(jī)磷細(xì)菌的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical features of organic phosphate-mineralizing strains

注：“+”表示反應(yīng)呈陽性，反之則表示為“-”。

2.3.2Biolog鑒定

9株高效解磷細(xì)菌在Biolog鑒定板培養(yǎng)16～24 h時的度數(shù)相似值 (SIM) 均大于0.50，符合Biolog系統(tǒng)理想結(jié)果要求。菌株LQYJ1、LQYJ3、LQYJ4、LQYJ6和LQYJ7均鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 (S.ma-ltophilia)，菌株LQYJ9為嗜根寡養(yǎng)單胞菌 (S.rhiz-ophila)，菌株LQYJ2為熒光假單胞菌 (P.fluoresce-ns)，LQYJ8為蠟狀芽孢桿菌 (B.cereus)，LQYJ5為密歇根克雷伯菌 (K.michiganensis)。

2.3.316S rDNA分子鑒定

分別以9株解磷菌株基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的1.5 Kb左右長度的DNA片段 (圖3) 經(jīng)測序后提交到GenBank注冊獲取登錄號，分別為MG213728、MG213729、MG213730、MG213731、MG213732、MG213733、MG213734、MG213735和MG525171。將9株菌株與相近屬種模式菌株的16S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖4)，分析表明菌株LQYJ1、LQYJ3、LQYJ4、LQYJ6和LQYJ7均與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 (S.maltophilia)的親緣關(guān)系較近，菌株LQYJ9、LQYJ2、LQYJ8 和LQYJ5分別與S.rhizophila、P.fluorescens、B.cereus和K.mic-higanensis聚在一起。結(jié)合9株菌的形態(tài)特征、生理生化特性、Biolog鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果，分別將菌株LQYJ1、LQYJ3、LQYJ4、LQYJ6和LQYJ7鑒定為為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 (S.maltophilia)，菌株LQYJ9為嗜根寡養(yǎng)單胞菌 (S.rhizophila)，菌株LQYJ2為熒光假單胞菌 (P.fluorescens)，LQYJ8為蠟狀芽孢桿菌 (B.cereus)，LQYJ5為密歇根克雷伯菌 (K.michiganensis)。研究結(jié)果表明，連翹根際土壤解有機(jī)磷細(xì)菌具有較豐富的種屬多樣性。

1～9分別代表菌株LQYJ1-LQYJ9。

圖3解有機(jī)磷細(xì)菌16SrDNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果
Fig.3 Result of garose gel electrophoresis of 16S rDNA gene PCR product of organic phosphate-mineralizing strains

括號內(nèi)為登錄號；分支上數(shù)字為樹形可信度；比例尺顯示水平線長度。

圖4解有機(jī)磷細(xì)菌的16SrDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of organic phosphate-mineralizing strains

3 結(jié)論與討論

解磷細(xì)菌作為一類能將土壤中難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為能直接被農(nóng)作物吸收利用的可溶性磷的有益微生物已引起廣泛重視，但是對藥用植物的研究卻相對較少。目前，國內(nèi)外對解磷細(xì)菌的研究大多集中于解無機(jī)磷細(xì)菌[19]。如馬驄毓等[20]從黃芪 (Astragalusmembranaceus) 根際土壤分離獲得具有應(yīng)用潛力的解磷菌株7株；任嘉紅等[21]從南方紅豆杉 (Taxuschinensisvar.mairei) 根際共分離出4株對南方紅豆杉苗期的生長有明顯促進(jìn)作用的高效溶無機(jī)磷細(xì)菌。林貴兵等[22]在丹參根際土壤中分離到有機(jī)磷分解菌；晉婷婷等[23]從南方紅豆杉根際分離到一株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 (Stenotrophomonas

maltophilia)，并證明具有高效解有機(jī)磷和顯著促進(jìn)南方紅豆杉苗木生長的能力。本從連翹根際土壤中分離篩選到9株具多種促生長特性的解有機(jī)磷細(xì)菌，分別鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、嗜根寡養(yǎng)單胞菌 (S.rhizophila)、熒光假單胞菌 (Pseudomonasfluorescens)、蠟狀芽孢桿菌 (Bacilluscereus) 和密歇根克雷伯菌 (Klebsiellamichiganensis)，其中解有機(jī)磷能力較強(qiáng)的菌株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、嗜根寡養(yǎng)單胞菌目前還未見報道，這為藥用植物連翹微生物肥料的開發(fā)提供了優(yōu)良的菌種資源，對于連翹人工繁殖和野生資源保護(hù)具有重要意義。

本研究從連翹根際篩選到的9株解有機(jī)磷細(xì)菌，解磷量分別在52.05～1.07 mg/L之間，其中4株解有機(jī)磷細(xì)菌的解磷量在30.00 mg/L以上。而王琛等[24]對九龍江口海水和沉積物中分離得到的10株解有機(jī)磷細(xì)菌進(jìn)行解磷能力測定發(fā)現(xiàn)，菌株XMYP7的解磷量最大，為0.030 5 mg/L；伍善東等[25]從油菜 (Brassicanapus) 根際土壤篩選得到的4株解有機(jī)磷細(xì)菌，解磷量在8.59～28.34 mg/L；白變霞等[26]從南方紅豆杉 (Taxuschinensisvar.mairei) 根際土壤分離得到的解有機(jī)磷菌株CLY07的解磷量為26.62 mg/L?？偟膩碚f，與目前已報道的解有機(jī)磷細(xì)菌的解磷能力相比，本試驗篩選的菌株LQYJ6、LQYJ1、LQYJ9和LQYJ3解有機(jī)磷能力較強(qiáng)，具有一定的應(yīng)用潛力。另外，項目組還嘗試過連翹根際溶無機(jī)磷菌株的分離篩選，但均未成功獲得。分析其原因可能是受土壤質(zhì)地、類型的影響，也有可能是與連翹根部產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對根際的微生物種群有一定影響，限制了具有溶無機(jī)磷能力微生物的生長，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

不少研究者報道解磷細(xì)菌還可通過產(chǎn)生生長素和嗜鐵素等調(diào)節(jié)植物生長的物質(zhì)來促進(jìn)植物生長發(fā)育，且具有多種促生長特性 (如產(chǎn)嗜鐵素、產(chǎn)生長素、產(chǎn)NH3、產(chǎn)HCN和具ACC脫氨酶活性等) 對植物的促生效應(yīng)更顯著[27]。如孟麗媛等[28]從水稻根際土壤篩選出的同時具產(chǎn)嗜鐵素、吲哚乙酸 (IAA)、解磷能力和ACC脫氨酶活性的菌株均在不同程度上對水稻幼苗的初生根數(shù)、次生根數(shù)、莖干質(zhì)量和根干質(zhì)量等具促生作用。Glick等證明同時含ACC脫氨酶活性和產(chǎn)IAA能力的促生菌株可以刺激宿主植物生長發(fā)育[29]。Dimkpa等證明接種同時含ACC脫氨酶活性和產(chǎn)嗜鐵素能力的菌株對宿主植物的促生作用優(yōu)于單接種且抗逆能力增強(qiáng)[30]。本研究從連翹根際土壤篩選出了9株具有多種促生特性的高效解磷細(xì)菌，其中菌株LQYJ6、LQYJ3、LQYJ5和LQYJ8具有3種以上的促生特性，應(yīng)具有一定的田間應(yīng)用潛力，但鑒于不同菌株促生機(jī)理的復(fù)雜性仍需要進(jìn)一步深入研究。

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