8種美洲黑楊無性系抗寒性評價

田 星 樊軍鋒 張錦梅

(西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

楊樹隸屬于楊柳科 (Salicaceae)、楊屬 (Populus)，在世界范圍內(nèi)分布廣泛且適應(yīng)性強。在北半球溫帶、寒溫帶，從低海拔到4 800 m的高海拔、北緯22°～70°均有分布[1]。作為用途廣泛的加工業(yè)原料、防護林樹種、能源樹種，楊樹越來越受到市場的青睞[2]。近年來，隨著人工雜交優(yōu)良楊樹品種和豐產(chǎn)栽培技術(shù)的廣泛應(yīng)用，中國已成為世界上楊樹人工林最大的國家[3]。氣溫驟降對植物傷害極大[4]，在我國北方地區(qū)，楊樹在生長過程中常會受到低溫脅迫，而目前大部分速生豐產(chǎn)系不耐低溫。楊樹本身屬于耐寒樹種，但由于其品系不同，抗寒性也存在較大差異[4-5]。因此，探討楊樹的抗寒機理，分析其抗寒性，篩選出不同抗寒品種，對楊樹引種和栽培推廣具有較高的實踐價值和指導(dǎo)意義。

國內(nèi)外學(xué)者篩選鑒定不同抗寒性楊樹品種的途徑有3個：一是楊樹天然雜種選擇，世界各知名楊樹研究機構(gòu)均從天然楊樹雜種中篩育出了眾多優(yōu)異抗逆品種，如意大利楊樹研究機構(gòu)經(jīng)由歐美楊 (Populus×euramericana) 天然雜種篩育出知名抗寒品種I-214，其特性優(yōu)異并被廣泛引種于各楊樹栽植地域[6]；二是楊樹天然雜交育種選擇，徐緯英等[7]采用青楊 (Populuscathayana)×鉆天楊 (P.nigra) 篩育出知名抗寒品系北京楊 (P.beijingensis)，徐緯英等[8]經(jīng)由小葉楊 (P.simonii)× 鉆天楊篩育出知名抗寒品系合作楊 (P.opera)；三是楊樹基因工程育種選擇，近年楊樹基因工程育種在我國發(fā)展迅速，如楊樹經(jīng)由擬南芥 (Arabidopsisthaliana) Fe SOD基因顯著提升了轉(zhuǎn)化植株的低溫逆境抗性表現(xiàn)[9]，Jouanin等[10]經(jīng)由 CHS 基因顯著提升了轉(zhuǎn)化楊樹植株的抗寒性。

經(jīng)過育種選擇后的新品種需要進一步測定方可推廣和應(yīng)用。目前，評定林木抗寒性的主要指標(biāo)有形態(tài)、生理生化和代謝指標(biāo)[8]。本研究以8個黑楊品種為試驗材料，通過測定與其生理生化密切相關(guān)的生理指標(biāo)，如半致死溫度 (LT50)、超氧化物歧化酶 (SOD) 活性、過氧化物酶 (POD) 活性、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、丙二醛 (MDA) 質(zhì)量摩爾濃度等，并結(jié)合隸屬函數(shù)方法對8個無性系抗寒情況進行比較與評價，探討楊樹抗寒性結(jié)構(gòu)指標(biāo)的篩選方法，為抗寒造林樹種的選擇提供科學(xué)依據(jù)，促進楊樹優(yōu)良種質(zhì)資源的推廣和應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院林木育種課題組以2013年營造的美洲黑楊試驗林為研究對象，在該試驗林中選擇5個無性系為供試材料，以長期在陜西地區(qū)廣泛栽培、前期試驗已初步證明具有耐寒品質(zhì)的69楊、陜林3號、南抗楊為CK品種，共8個均來自于渭河地區(qū)品種為試驗材料 (表1)。

表1 試驗材料遺傳背景Table 1 Experiment materials and their genetic background

1.2 試驗方法

2016年12月中旬，在渭河試驗站中選擇各品種地徑接近2 cm、無任何疾病、生長情況一致的1年生休眠苗進行研究。8個黑楊無性系各 15株，去除頂梢干枯的部分，自上向下截取至1.5 m處、修剪為20 cm枝段并平均分成 6部分，一份60枝，各溫度設(shè)置10枝重復(fù)。枝段先用自來水沖洗，再用離子水多次洗滌，濾紙吸干。清洗時注意刮掉部分木栓，但不致使樹皮遭到破壞。之后將枝段置于超低溫冰箱中進行低溫處理，低溫處理時間為24 h，處理溫度分別設(shè)定為-15、-20、-25、-30、-35 ℃，降溫速率為 4 ℃/h，以常溫 (試驗站采樣后直接測定) 作為CK溫度。由于冰箱通常的降溫速率為4 ℃/h，且降溫需要有個過程，因此選擇4 ℃/h為降溫速率。此外，已有成果表明這種降溫速率增加了品種適應(yīng)過程，可以更好地反映各個梯度下酶的活性。達(dá)到所需溫度后繼續(xù)維持24 h，每間隔5 ℃取出一批枝條用于相對電導(dǎo)率、MDA質(zhì)量摩爾濃度、SOD活性、POD活性和可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定。

1.3 測定方法

1.3.1半致死溫度測定

把經(jīng)過低溫處理的各品種枝條切為0.5 cm的小段，用天平稱取1.0 g置于100 mL的容器里，加入去離子水適量，充分搖勻之后于溫度為25 ℃的搖床中震蕩1 d，震蕩之后通過電導(dǎo)設(shè)備獲取電導(dǎo)情況E1，隨后把試驗品置于沸水里水浴35 min，水浴之后進行冷卻至室溫，測定電導(dǎo)率E2[11]，按公式 (1) 計算相對電導(dǎo)率 (y)，重復(fù)3次。采用不同溫度設(shè)置下的相對電導(dǎo)率和Logistic方程相結(jié)合的方法確定[12-13]，如公式 (2)。其中，Logistic方程運用四點法求出擬合曲線，其擬合方程見公式 (3)。按公式 (4) 和 (5) 求解k以及方程參數(shù)a、b。

y=∣E2-E1∣

(1)

LT50=ln(a)/b

(2)

y=k/(1+ae-bx)

(3)

k=[y1y4(y2+y3)-y2y3(y1+y4)]/

(y1y4-y2y3)

(4)

x2+x3=x1+x4

(5)

式中：y為相對電導(dǎo)率，x為處理的溫度 (℃)，k為細(xì)胞的飽和傷害情況。

1.3.2酶活性測定

粗酶通過含0.5% Triton100的磷酸鹽緩沖液 (PBS) 獲取，SOD活性參照李合生[14]提出的方法測定，POD活性參照鄒琦[15]提出的方法測定。

1.3.3可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、MDA質(zhì)量摩爾濃度測定

參照鄒琦[15]提出的方法進行，各無性系重復(fù)3次。

1.4 評價方法

通過隸屬函數(shù)法，計算各生理指標(biāo)綜合隸屬函數(shù)值 (∑Tij)，對各生理指標(biāo)抗寒性開展定量評價[16]。按公式 (6) 計算各指標(biāo)隸屬函數(shù)，如果某個指標(biāo)和系統(tǒng)的分析情況屬于負(fù)相關(guān)，則通過反隸屬函數(shù)實施轉(zhuǎn)換，如公式 (7)。綜合隸屬函數(shù)值 (∑Tij) 計算方法參考許桂芳等[17]研究結(jié)果。

(6)

(7)

式中：U(xi)為隸屬函數(shù)的大??；Xi為無性系特定項指標(biāo)測定值；Xmin、Xmax為全部參試無性系里某個指標(biāo)的最高值以及最低值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和多重比較，采用DPS 7.05完成數(shù)據(jù)的差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對無性系各生理指標(biāo)的影響

2.1.1半致死溫度

由表2可知，各無性系在低溫中的Logistic方程擬合度極顯著 (P< 0.01)，擬合度最高的為無性系 ‘08H4-5’，擬合度為0.987 8；擬合度最低的為無性系 ‘08H11-11’，擬合度為0.920 1，說明各黑楊無性系LT50和相對電導(dǎo)率差異顯著 (P< 0.05)。根據(jù)各無性系枝條LT50，無性系可分為3類：第1類LT50為-40 ℃左右，僅有南抗楊，其低溫逆境生理抗性表現(xiàn)最強；第2類 LT50為-30 ℃～-35 ℃，包括 ‘08H1-6’、 ‘08H11-11’、‘03S4-1’，其低溫逆境的生理抗性表現(xiàn)強；第3類LT50為-25 ℃～-30 ℃，其低溫逆境生理抗性表現(xiàn)較弱。LT50由低到高依次排序為：南抗楊 < ‘08H1-6’ < ‘03S4-1’ < ‘08H11-11’ < 69楊 < ‘08H2-16’ < ‘08H4-5’ < 陜林3號。其中，南抗楊的LT50最小，這表明其在所有無性系中抗寒性最強。有研究表明，主要原因是不同無性系在不同處理溫度下電解質(zhì)滲出率表現(xiàn)差異顯著，隨著溫度降低，各無性系電導(dǎo)率出現(xiàn)不同程度的升高，抗寒性強的品種在較低溫度下電解質(zhì)滲出率出現(xiàn)較大增幅[11]。

表2 各無性系低溫下的Logistic方程和LT50Table 2 The Logistic equation and LT50 under low temperature of each clones

注：不同小寫字母表示差異顯著；**表示擬合度達(dá)到極顯著水平。

2.1.2低溫處理對各無性系酶活性的影響

由表3可知，隨著溫度的降低，各個無性系SOD活性先增強后減弱，且不同無性系達(dá)到活性峰值及活性變化的速率是不同。具體來講，在CK溫度下， ‘08H4-5’ 的SOD活性與其他7個無性系之間存在顯著差異 (P< 0.05)，同時，南抗楊與 ‘08H2-16’、陜林3號、 ‘03S4-1’、69楊之間也存在顯著差異 (P< 0.05)。當(dāng)處理溫度為-20 ℃時，‘03S4-1’ 的SOD活性達(dá)到峰值，其余7個無性系SOD活性達(dá)到最大值時的溫度均為-25 ℃。在-25 ℃下， ‘08H4-5’ 與 ‘08H2-16’、 ‘03S4-1’ 以及南抗楊存在顯著差異 (P< 0.05)。在-35 ℃下，SOD活性最弱的為 ‘08H4-5’，活性最強的為南抗楊。尤為明顯的是， ‘08H4-5’ 與南抗楊在每個溫度條件下的SOD活性均存在顯著差異 (P< 0.05)，可見兩者抗寒能力差異顯著 (P< 0.05)。

表3 低溫作用下各無性系SOD活性Table 3 SOD activity of each clone under the effect of low temperature U/g

注：不同小寫字母表示差異顯著。

由表4可知，在低溫處理下，POD活性變化與SOD 活性變化趨勢基本一致，隨著溫度的降低，POD活性變化先增強后減弱。在CK溫度下，各無性系POD活性無顯著差異。在-25 ℃時，除69楊以外的7個無性系POD活性均達(dá)到最大值，無性系間差異不顯著；在-35 ℃時，POD活性最弱的是陜林3號，活性最強的是 ‘03S4-1’。在低溫脅迫下，植物體內(nèi)大量積累的活性氧使膜脂發(fā)生過氧化作用，造成膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的破壞和功能的紊亂。生物為了應(yīng)對活性氧對機體的傷害形成了復(fù)雜的酶類抗氧化系統(tǒng)，如SOD、POD、CAT等，這些保護酶與植物的抗寒性呈線性關(guān)系。隨著溫度的變化，各個無性系均因溫度的降低而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生不等量的抗氧化酶，隨著溫度的進一步降低，這些抗氧化酶因低溫而失活等原因不再應(yīng)對損傷，由于各無性系抗寒能力的不同，這些抗氧化酶到達(dá)活性的臨界溫度也不同。

表4 低溫作用下各無性系POD活性Table 4 POD activity of each clone under the effect of low temperature U/(g·min)

注：不同小寫字母表示差異顯著。

2.1.3低溫處理對各無性系可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由表5可知，處于低溫環(huán)境里，同一無性系可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)出現(xiàn)一定的變化，不同無性系彼此之間存在差異性。所有的無性系隨著處理溫度的降低，植株體內(nèi)檢測到的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加，并且大部分在-25 ℃時達(dá)到最高點，這表明此溫度下給試驗材料造成的負(fù)面影響較大，試驗材料出現(xiàn)了應(yīng)激反應(yīng)。具體來講， ‘08H1-6’、陜林3號在-20 ℃可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值，分別為16.7 mg/g和13.8 mg/g，增加了4.32倍和3.17倍，與其它6個無性系差異顯著 (P< 0.05)。其它6個無性系均在-25 ℃可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值，其中 ‘03S4-1’ 無性系增幅較大，為原值的9.17倍； ‘08H4-5’ 無性系在整個過程中增幅較小，-25 ℃含量為12.69 mg/g，增幅為原值的3.73倍。有研究表明，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如可溶性糖、可溶性蛋白等的積累能夠提高植物的抗寒能力[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，可溶性蛋白的滲透調(diào)節(jié)能力是受溫度限制的，不同無性系達(dá)到可溶性蛋白最大質(zhì)量分?jǐn)?shù)時所處的溫度不同。其后由于可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)急劇減少，各無性系的抗低溫脅迫能力也會相應(yīng)降低。

2.1.4低溫處理對丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的影響

由表6可知，隨著溫度不斷降低，8個無性系MDA質(zhì)量摩爾濃度先升高后降低，但變化速率有差異。其中 ‘08H4-5’ 與其他無性系間存在顯著差異 (P< 0.05)，增加迅速且含量最多，與CK溫度相比，增幅為43%；增加最為緩慢的為 ‘08H2-16’，增加了9.7%。在CK溫度下， ‘08H4-5’、‘08H2-16’、‘08H1-6’、陜林3號和69楊的MDA質(zhì)量摩爾濃度與 ‘08H11-11’、‘03S4-1’ 和南抗楊存在顯著差異 (P< 0.05)。此外，在-20 ℃溫度下，陜林3號MDA質(zhì)量摩爾濃度最高，且與其它無性系差異達(dá)顯著水平 (P< 0.05)。除陜林3號以外，7個無性系在-25 ℃下的MDA質(zhì)量摩爾濃度達(dá)到最大值。在-35 ℃下，MDA質(zhì)量摩爾濃度最高的為 ‘08H4-5’，最低的為南抗楊。

表5 低溫作用下各無性系可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 5 Soluble protein mass fraction of each clone under the effect of low temperature mg/g

注：不同小寫字母表示差異顯著。

表6 低溫作用下各無性系MDA質(zhì)量摩爾濃度Table 6 MDA molality of each clone under the effect of low temperature mmol/g

注：不同小寫字母表示差異顯著。

2.2 各無性系抗寒能力綜合評價結(jié)果

由表7可知，8個美洲黑楊無性系Tij大小依次為南抗楊 > ‘08H1-6’ > ‘03S4-1’ > ‘08H11-11’ > 陜林3號 > ‘08H2-16’ > 69楊 > ‘08H4-5’。Tij越大說明其抗寒性越強，在8個無性系中，Tij最大的為南抗楊，說明其在所有無性系中抗寒性最強；Tij最低的為‘08H4-5’，說明其在所有無性系中抗寒性最差。

表7 無性系抗寒能力綜合評價Table 7 Comprehenvis evaluation on cold resistance of each clones

3 結(jié)論與討論

20世紀(jì)很多研究人員發(fā)現(xiàn)，低溫導(dǎo)致植物細(xì)胞中結(jié)冰、細(xì)胞膜損壞，但植物的抗寒性卻使它們對低溫表現(xiàn)出不同的適應(yīng)性，也會產(chǎn)生不同的抗寒生理機制[18]。胡建芳等[4]在研究國內(nèi)外抗寒性進展和方法的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)通過對相對電導(dǎo)率、脯氨酸、可溶性蛋白、MDA及保護酶系統(tǒng)等指標(biāo)的具體分析，能夠?qū)χ参锏目购宰龀隹茖W(xué)判斷。電導(dǎo)率測定是使用最多的方法[19]，低溫下細(xì)胞的膜透性增大，造成電解質(zhì)外滲，溫度愈低，電解質(zhì)滲透率越大，相對電導(dǎo)率越大[20]。此外，抗氧化酶系統(tǒng)中SOD、POD、PPO等酶活性變化情況也是最近被大量使用當(dāng)作分析抗寒性的關(guān)鍵數(shù)據(jù)，并且這些酶的變化屬于低溫狀況下植物進行自我保護的機制[21]。同時，MDA也被作為分析膜透性的指標(biāo)用于植物抗寒性的研究[22]。

本研究根據(jù)實際情況選擇LT50、SOD活性、POD活性、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、MDA質(zhì)量摩爾濃度5項指標(biāo)對8個供試楊樹無性系的抗寒性進行評價。結(jié)果表明，8個供試楊樹無性系的耐寒情況從高到低排序為南抗楊 > ‘08H1-6’ > ‘ 03S4-1’ > ‘08H11-11’ > 陜林3號 > ‘08H2-16’ > 69楊 > ‘08H4-5’。這與通過LT50判斷的抗寒能力結(jié)果一致，說明通過電導(dǎo)率測定計算LT50可以判斷植物的抗寒性強弱，與相關(guān)研究一致[23]。同時，各無性系的LT50可以為以后的適地引種提供借鑒。南抗楊抗寒性顯著高于其他無性系 (P< 0.05)； ‘08H1-6’、‘08H11-11’、‘03S4-1’ 的抗寒性介于陜林3號與南抗楊之間，可以作為優(yōu)良抗寒種質(zhì)資源加以推廣和應(yīng)用； ‘08H2-16’ 其抗寒性介于69楊和陜林3號之間，也可作為楊樹栽培過程中較為理想的材料。

低溫導(dǎo)致植物出現(xiàn)抗寒性反應(yīng)十分復(fù)雜，被很多因素所影響[24-25]。自然環(huán)境復(fù)雜多變，人工低溫脅迫不可能完全反映出自然條件的凍害情況。本研究在模擬低溫環(huán)境下進行，能夠?qū)Σ煌参锏目购宰龀鲆欢ǖ呐袛?，但可能與各無性系實際抗寒性存在偏差[26-29]。因此，對于導(dǎo)致抗寒生理生化改變的分子機制、通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)徹底提高抗寒性的相關(guān)研究，仍是今后重要的研究方向。

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