二噁英暴露對成年男性血清類固醇激素的影響

沈 斌 ,施麗麗 ,董晶劍 ,馮 昊 ,沈林杰 ,項(xiàng) 菁 ,李文靜 ,羅 挺 ,城戶照彥 ,孫獻(xiàn)亮 ,*(.嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院,浙江 嘉興 3400；.日本金澤大學(xué)醫(yī)藥保健學(xué)院保健學(xué)系,日本 金澤 908640)

二噁英是多氯代二苯并二噁英(PCDDs)、多氯二苯并呋喃(PCDFs)的統(tǒng)稱,主要來源于金屬冶煉、礦石燒結(jié)、水泥制造、廢物焚燒等大型工業(yè)生產(chǎn)及生活垃圾焚燒[1-4].二噁英作為一種持久性有機(jī)污染物,脂溶性高,極難降解,在生物體內(nèi)的半衰期約為 7～11a,影響持久[5],對環(huán)境和人類健康造成嚴(yán)重危害.長期接觸二噁英會(huì)造成免疫系統(tǒng)、發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及生殖功能的損害[6],其中最主要的危害是對內(nèi)分泌的干擾.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),二噁英類物質(zhì)中毒性最強(qiáng)的四氯二苯并二噁英(TCDD)通過影響小鼠芳香烴受體(AhR)的表達(dá),降低類固醇激素孕酮、雄烯二酮、睪酮和雌二醇水平[7],此外,TCDD通過影響芳香酶(CYP19A1)的活化,降低雌二醇分泌[8].流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),二噁英的潛在暴露會(huì)導(dǎo)致兒童類固醇激素睪酮、雌二醇水平降低[9],脫氫表雄酮水平升高[8].而成年女性暴露二噁英導(dǎo)致皮質(zhì)醇和可的松水平升高[11].近年關(guān)于越南戰(zhàn)爭期間服役的美軍退役士兵的研究中發(fā)現(xiàn),TCDD暴露導(dǎo)致男性士兵睪酮水平降低[12],患前列腺癌癥的風(fēng)險(xiǎn)提高[13-14].然而上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與美軍退役士兵的研究中并未對其他種類的二噁英同類物進(jìn)行測定.

在越南戰(zhàn)爭期間美軍使用了大量含有二噁英的枯葉劑,對當(dāng)?shù)丨h(huán)境和居民健康造成了嚴(yán)重危害.雖然二噁英的使用(1962～1971年)已經(jīng)過去了40多a,但是污染地區(qū)土壤中、周邊居民血液中的二噁英濃度仍比非污染地區(qū)高出 3-5倍[15-16].由于二噁英分析屬于超痕量分析,分析成本高,故在越南國內(nèi)關(guān)于二噁英對人體健康危害的研究較少.為了解二噁英暴露對越南成年男性類固醇激素分泌的干擾,本研究于 2011～2012年對二噁英污染地區(qū)的50名成年男性和非污染地區(qū)的48名成年男性的血清中9種類固醇激素和17種二噁英同類物進(jìn)行了調(diào)查分析.

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域

污染地區(qū)選擇了越南Bien Hoa地區(qū),在越南戰(zhàn)爭期間存放了大量農(nóng)藥并大量噴灑使用. Bien Hoa位于越南Dong Nai省,是越南南部3個(gè)具有代表性的二噁英污染地區(qū)之一[15-16].研究區(qū)域詳見圖1.

圖1 研究區(qū)域Fig.1 Map of Vietnam and study areas

1.2 樣品采集

本研究隨機(jī)選取二噁英污染地區(qū)50名男性和非污染地區(qū)48名男性為受試者,所有被試者的年齡均在50歲以上,在調(diào)查地區(qū)居住時(shí)間40a以上,為確保類固醇激素檢出的準(zhǔn)確性,所有樣品的采集均在上午8:00～10:00之間進(jìn)行,采集血液樣本 10mL,離心后血清放入采樣小瓶內(nèi),保存于放有干冰的冷藏盒內(nèi).采樣結(jié)束后統(tǒng)一存放于-30℃低溫冰箱內(nèi)直到分析測試.

1.3 樣品處理與分析

1.3.1 血清中二噁英的測定(1)實(shí)驗(yàn)材料 正已烷、甲苯(色譜純,美國Heneywell公司);二氯甲烷(色譜純,德國 Merck公司);乙酸乙酯(色譜純,日本W(wǎng)ako公司);硅藻土(德國Merck公司);二噁英標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(除去 2,3,7,8-TeCDF、2,3,7,8-TeCDD濃度為40ng/mL,OCDD、OCDF濃度為400ng/mL,其他濃度均為200ng/mL)、13C12標(biāo)記的二噁英回收內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液(除13C12濃度為200ng/mL外,其余濃度均為100ng/mL)、13C12標(biāo)記的二噁英添加內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為200ng/mL)(美國Well-labs,Wellington公司).

(2)樣品前處理

取4mL血清加入10μL13C12標(biāo)記的二噁英標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后轉(zhuǎn)移至少量硅藻土上,在-40℃冰箱冷凍 6h后,放入冷凍干燥機(jī)干燥.凍干后樣品加入適量硅藻土研磨混勻后,加于快速溶劑提取儀的萃取池中(ASE350,美國 Thermo Fisher Scientific公司),配制體積比為1:1的正己烷與二氯甲烷混合溶劑作提取溶劑,用 ASE350提取樣品中的二噁英.

(3)樣品的純化

將提取液轉(zhuǎn)移至250mL茄形瓶中,濃縮至恒重,稱取并記錄脂肪重量,加入10μL13C12標(biāo)記的二噁英標(biāo)準(zhǔn)溶液和150mL正己烷混勻,在45℃下減壓旋蒸至 5mL,以全自動(dòng)凈化系統(tǒng)進(jìn)行凈化(Fluid Management System,美國 FMS 公司),收集含有二噁英的洗脫液.將收集的二噁英洗脫液過酸性硅膠柱,洗脫液濃縮至微干,加 5μL13C12標(biāo)記的二噁英作為內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液,并轉(zhuǎn)至錐形樣品瓶中待上機(jī)檢測.

(4)儀器分析

采用HP6890HRGC(美國Hewlett Packard公司)和 JEOL JMS-S700HRMS(美國 Therm Finnigan公司)聯(lián)用分析儀.

色譜條件:DB-5MS(60m×0.25mm×0.25L)色譜柱對17種二噁英單體進(jìn)行分離.色譜柱升溫程序:初始溫度80℃保持2min,以20℃/min速率升至180℃,再以5℃/min速率升至300℃保持3min.

質(zhì)譜條件:電離方式,ESI源;電離能量,35eV;采用選擇離子(SIM)測定;離子源溫度,300℃.

(5)質(zhì)量控制

嚴(yán)格按照美國國家環(huán)保局EPA1613方法對樣品分析過程進(jìn)行質(zhì)量控制,確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確.采用13C同位素內(nèi)標(biāo)稀釋定量法對血清中二噁英進(jìn)行定量.背景干擾以扣除實(shí)驗(yàn)空白為準(zhǔn).結(jié)果表明,空白實(shí)驗(yàn)組的回收率介于 33.4%～119%;樣品回收率范圍:30%～120%,在EPA檢測方法的可接受范圍之內(nèi).

1.3.2 血清中類固醇激素的測定(1)主要儀器和試劑 API4000三重四極桿質(zhì)譜儀(加拿大MDS Sciex公司);Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)及PTC自動(dòng)進(jìn)樣器(德國 Waldbronn公司);高速離心機(jī)(日本Shimadazu公司)等.

皮質(zhì)醇、可的松、孕酮、雄烯二酮、雌酮(Estrone)、睪酮、雙氫睪酮、脫氫表雄酮、雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品(德國 Merck公司);甲醇(色譜純,美國Heneywell公司);乙酸乙酯(色譜純,日本W(wǎng)ako公司);羥胺(日本 Wako公司)等.

(2)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品用乙酸乙酯準(zhǔn)確定容,然后分裝并放置-70℃保存?zhèn)溆?取少量標(biāo)準(zhǔn)品乙酸乙酯溶液用甲醇準(zhǔn)確定容稀釋成濃度為100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于-30℃保存.按照9種類固醇激素在人體血清中的大致含量將標(biāo)準(zhǔn)品按比例配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品,再用生理鹽水稀釋到不同濃度.配制濃度為 100ng/mL的皮質(zhì)醇-2H4(1ng),脫氫表雄酮-2H4(100pg),孕酮-13C3(100pg),雌酮-13C4(100pg)和雌二醇-13C4(100pg)混合內(nèi)標(biāo)水溶液備用.

(3)樣品前處理

取 200μL血清加入 1.5mL離心管中,加100ng/mL混合內(nèi)標(biāo)溶液 20μL,再加入 600μL乙酸乙酯,渦旋振蕩 10min,12000×g離心 5min,4℃靜置30min后取上清液用氮吹儀吹干,加入羥胺100μL,混勻振蕩 10min,再放入恒溫箱 60℃衍生化反應(yīng)1h,待上機(jī)檢測.

(4)儀器分析

采用AT1000LC和API4000MS聯(lián)用分析儀(LC-MS/MS).

色譜條件:采用 Phenomenex C18反相色譜柱(100mm×2.1mm, 2.6μm)和 PhenomenexC18 預(yù)保護(hù)柱.流動(dòng)相A為H2O(含0.1%甲酸),流動(dòng)相B為甲醇(含 0.1%甲酸).柱溫為 35℃,進(jìn)樣體積為20μL.

質(zhì)譜條件:電離方式, ESI源;采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)的質(zhì)譜掃描模式.噴霧電壓(IS)為5500V;碰撞氣(CAD)為 Medium;氣簾氣(CUR)為40kPa;離子源霧化氣(GS1)和加熱輔助氣(GS2)均為60kPa;去溶劑溫度為550℃.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 12.0軟件和 JMP @ 9軟件包(SAS institute,Cary,NC,USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.本文中數(shù)據(jù)由均值±SD或由中位數(shù)及四分位數(shù)間距來表示.采用 Student t檢驗(yàn)(正態(tài)分布)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)(非正態(tài)分布)進(jìn)行組間比較.由于血清中的二噁英濃度和類固醇激素濃度均為非正態(tài)分布,故采用 spearman相關(guān)分析法,進(jìn)行相關(guān)分析.

2 結(jié)果

2.1 兩個(gè)地區(qū)受試者人群特征的比較

本文隨機(jī)選取二噁英污染地區(qū)的 50名成年男性及非污染地區(qū)的 48名成年男性作為受試者.如表1所示,兩個(gè)地區(qū)的受試者年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、受教育程度上沒有顯著性差異.在居住時(shí)間上,污染地區(qū)的受試者的居住時(shí)間明顯長于非污染地區(qū)的受試者,且所受試者在該地區(qū)的居住時(shí)間均在50a以上.從而確保了受試者在越南戰(zhàn)爭期間到調(diào)查實(shí)施期間都居住在所調(diào)查地區(qū).

表1 兩個(gè)地區(qū)受試者人群特征的比較Table 1 Demographic characteristics of participants in the two areas

2.2 兩個(gè)地區(qū)受試者血清中類固醇激素水平的比較

兩個(gè)地區(qū)男性受試者血清類固醇激素水平如表 2所示,二噁英污染地區(qū)及非污染地區(qū)受試者體內(nèi)皮質(zhì)醇、可的松、孕酮、雄烯二酮、雌酮水平?jīng)]有顯著性差異(P＞0.05).污染地區(qū)受試者血清中睪酮、雙氫睪酮、雌二醇的水平均高于非污染地區(qū),而脫氫表雄酮的水平低于非污染地區(qū),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05).

表2 兩個(gè)地區(qū)男性受試者血清類固醇激素水平的比較Table 2 Comparison of serum levels of steroid hormones in males from the two areas

2.3 兩個(gè)地區(qū)受試者血清中二噁英濃度的比較

表 3是對兩個(gè)地區(qū)男性受試者血清中 17種二噁英同類物濃度的比較.從結(jié)果可知,在二噁英污染地區(qū)受試者血清中的各二噁英同類物中除2378-TeCDF、12378-PeCDF、123789-HxCDF、1234789-HpCDF、OCDF外,其他 12種二噁英同類物及PCDDs、PCDFs、PCDD/DFs毒性當(dāng)量均高于非污染地區(qū),各差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).其中 12378-PeCDD、123678-HxCDD、1234678-HpCDD、OCDD、123478-HxCDF、123678- HxCDF、1234678-HpCDF的濃度比非污染地區(qū)高 5～10倍.PCDDs、PCDFs、PCDD/DFs毒性當(dāng)量比非污染地區(qū)高3倍以上.

表3 兩個(gè)地區(qū)男性受試者血清中二噁英水平的比較Table 3 Comparison of serum levels of dioxins in males from the two areas

續(xù)表3

2.4 兩個(gè)地區(qū)受試者血清中類固醇激素與二噁英的相關(guān)性

表4可見,雌二醇的水平與17種二噁英同類物 12378-PeCDD、123678-HxCDD、1234678-HpCDD、1234678-HpCDF呈顯著性正相關(guān).睪酮的水平與 123678-HxCDD、1234678-HpCDD、OCDD、1234678-HpCDF呈顯著性正相關(guān),雙氫睪酮的水平與1234678-HpCDD、OCDD呈顯著性正相關(guān).脫氫表雄酮的水平與 123678-HxCDD呈顯著性負(fù)相關(guān).皮質(zhì)醇、可的松、孕酮、雄烯二酮、雌素酮的水平與二噁英濃度沒有顯著性相關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示).

表4 兩個(gè)地區(qū)類固醇激素與二噁英的相關(guān)性Table 4 Correlation between steroid hormones and dioxins in the two areas

2.5 年齡與類固醇激素的相關(guān)性

表 5可見,污染地區(qū)成年男性血清中睪酮、雙氫睪酮、雌二醇的水平隨年齡的增長而增高,而脫氫表雄酮的水平隨著年齡增長而降低,以上相關(guān)性均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).二噁英非污染地區(qū)男性血清中雙氫睪酮、睪酮、雌酮、脫氫表雄酮的水平變化與普通男性變化趨勢一致[17-19].

表5 年齡與類固醇激素的相關(guān)性Table 5 Correlation of steroid hormones and age

續(xù)表5

3 討論

越南戰(zhàn)爭已經(jīng)過去了40多a,二噁英在人體血清中的濃度大幅降低[16,20],但本研究污染地區(qū)成年男性血清中二噁英毒性當(dāng)量仍比非污染地區(qū)高出3倍以上.

本研究發(fā)現(xiàn),睪酮的水平與二噁英同類物123678-HxCDD、1234678-HpCDD 、OCDD、1234678-HpCDF呈顯著性正相關(guān),二噁英污染地區(qū)睪酮水平明顯高于非污染地區(qū),且水平隨著年齡的增長而升高.男性睪酮由睪丸分泌,腎上腺亦分泌少量睪酮,一般成年男性的睪酮水平隨年齡的增長而降低[19].動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)雄性大鼠的腦垂體可能是二噁英的靶器官,二惡英的暴露導(dǎo)致腦垂體機(jī)能下降,從而干擾血漿睪酮、雌二醇之間的正常反饋機(jī)制,導(dǎo)致睪酮、雌二醇水平異常[21].然而Araki等[22]在人群實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn),嬰兒臍帶血中睪酮水平的變化與其睪丸間質(zhì)細(xì)胞和血清細(xì)胞相關(guān).因此,我們認(rèn)為二噁英對人體類固醇激素睪酮的影響機(jī)制與動(dòng)物不同,本研究中污染地區(qū)成年男性睪酮水平的增高可能是由二噁英直接作用與睪丸間質(zhì)細(xì)胞和血清細(xì)胞引起.

雙氫睪酮可由睪丸直接生成,也可由睪酮與人體內(nèi) 5α-轉(zhuǎn)化酶反應(yīng)后生成[23].本研究發(fā)現(xiàn),雙氫睪酮的水平與1234678-HpCDD、OCDD呈顯著性正相關(guān),二噁英污染地區(qū)雙氫睪酮水平明顯高于非污染地區(qū),且水平隨著年齡的增長而升高.研究發(fā)現(xiàn),二噁英暴露與 5α-轉(zhuǎn)化酶活性之間沒有顯著的相關(guān)性[24].本研究中雙氫睪酮水平的增高可能與睪酮水平的增高相似,即由二噁英直接作用與睪丸間質(zhì)細(xì)胞和血清細(xì)胞引起.

本研究發(fā)現(xiàn),雌二醇的水平與 12378-PeCDD、123678-HxCDD、1234678-HpCDD、1234678-HpCDF呈顯著性正相關(guān),二噁英污染地區(qū)成年男性血清中雌二醇的水平明顯高于非污染地區(qū),且水平隨年齡的增長而增高.作為男性雌激素中活性最高的雌二醇,其水平的變化與睪酮水平相關(guān),睪酮在芳香化酶作用下可轉(zhuǎn)化為雌二醇[25].最新的研究發(fā)現(xiàn),二噁英暴露導(dǎo)致腫瘤塊中芳香烴受體表達(dá)水平增加,雌二醇可能通過雌激素受體與芳香烴受體之間的相互作用而影響芳香烴受體的表達(dá)[26].本研究中二噁英污染地區(qū)雌二醇水平的升高可能是,二噁英暴露導(dǎo)致的芳香烴受體與雌激素受體表達(dá)變化與睪酮水平升高共同作用的結(jié)果.

多項(xiàng)研究表明,高水平的睪酮與低水平的性激素結(jié)合球蛋白會(huì)導(dǎo)致成年男性患前列腺癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加[27-28],雌二醇與雄激素協(xié)調(diào)作用會(huì)誘發(fā)前列腺疾病[29].另外研究發(fā)現(xiàn),低水平雙氫睪酮的成年男性罹患前列腺癌的分險(xiǎn)系數(shù)較低[30].前列腺作為睪酮、雙氫睪酮和雌二醇的目標(biāo)器官被人們熟知.由此推測,二噁英暴露導(dǎo)致的睪酮、雙氫睪酮和雌二醇水平的增高可能會(huì)誘發(fā)前列腺疾病.由于本次研究并未對被試前列腺疾患進(jìn)行診斷,因此,這一結(jié)論有待在今后的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證.

研究表明,人體脫氫表雄酮水平隨年齡的增長而降低,是人類衰老的生物標(biāo)志物[31].本研究中,脫氫表雄酮的水平與123678-HxCDD呈顯著性負(fù)相關(guān),二噁英污染地區(qū)成年男性脫氫表雄酮水平隨年齡降低的趨勢明顯大于非污染地區(qū)(污染地區(qū)vs非污染地區(qū)r= -0.3177vs r= -0.1957),二噁英暴露可能加速人體衰老.此外發(fā)現(xiàn),二噁英暴露會(huì)導(dǎo)致促腎上腺皮質(zhì)激素水平降低[32],脫氫表雄酮作為腎上腺激素,受促腎上腺皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)[33-34],這可能是導(dǎo)致本研究中脫氫表雄酮水平降低的主要原因.

本次研究中,17種二噁英同類物中氯數(shù)最少毒性最強(qiáng)的TCDD與類固醇激素?zé)o相關(guān)性,而氯數(shù)更多脂溶性更強(qiáng)的 12378-PeCDD、123678-HxCDD、1234678-HpCDD、OCDD、1234678-HpCDF與上述類固醇激素呈顯著性相關(guān)(P＜0.05).這一結(jié)果與我們之前所作的關(guān)于母乳中二噁英暴露對其子代類固醇影響的研究結(jié)果相似,即氯數(shù)更多脂溶性更強(qiáng)的二噁英同類物與類固醇激素表現(xiàn)出更強(qiáng)的相關(guān)性[10,35].二噁英同類物對人體的毒性作用需要在今后做進(jìn)一步的研究和討論.

4 結(jié)論

4.1 二噁英暴露導(dǎo)致成年男性性激素睪酮(污染地區(qū)6263pg/mLvs非污染地區(qū)5309pg/mL)和雌二醇(污染地區(qū) 12ng/mLvs非污染地區(qū)10ng/mL)水平增高,可能誘發(fā)患前列腺疾病風(fēng)險(xiǎn)增高.

4.2 二噁英暴露導(dǎo)致成年男性脫氫表雄酮水平隨年齡增長而降低趨勢明顯(污染地區(qū) r=-0.3177vs非污染地區(qū)r= -0.1957),致快速衰老的風(fēng)險(xiǎn)增高.

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