雷公藤甲素延緩糖尿病腎病進展的實驗研究

范鴻儒，楊繼紅，王萌，杜俊杰,方芳

(北京大學第五臨床醫(yī)學院 北京醫(yī)院 國家老年醫(yī)學中心,a 腎內科，b檢驗科，c 病理科，北京 100730)

·基礎研究·

雷公藤甲素延緩糖尿病腎病進展的實驗研究

范鴻儒a，楊繼紅a，王萌b，杜俊杰a,方芳c

(北京大學第五臨床醫(yī)學院 北京醫(yī)院 國家老年醫(yī)學中心,a 腎內科，b檢驗科，c 病理科，北京 100730)

[摘要]目的初步探討雷公藤甲素對C57BL/6-Ins2Akita小鼠的安全劑量和延緩糖尿病腎病的作用效果。方法選擇8周齡雄性C57BL/6-Ins2Akita小鼠和C57BL/6J野生鼠，每4周檢測體血糖和體質量，每8周收集24 h尿液和血液，檢測和對比糖尿病腎病相關指標，確定C57BL/6-Ins2Akita小鼠糖尿病腎病的評估和形成時機。另取8周齡C57BL/6-Ins2Akita小鼠以100、200、400、800 μg·kg-1·d-1分成4個劑量組灌胃14 d，觀察急性毒性反應，通過改良寇氏法計算LD50。以25、50、100 μg·kg-1·d-1這3個劑量干預24周齡C57BL/6-Ins2Akita小鼠，并設置空白對照組和野生型對照組，干預8周，期間收集尿液檢測24 h尿蛋白排泄率，處死后收集血液檢測肌酐、尿素氮、血清清蛋白等指標，組織取材進行病理檢查。結果C57BL/6-Ins2Akita小鼠的24 h尿蛋白排泄率、血糖、三酰甘油在8周齡開始即高于C57BL/6J野生型小鼠(P<0.05)，血清蛋白低于C57BL/6J野生型小鼠(P<0.05)，且隨周齡增加差距逐漸明顯，但肌酐未出現升高趨勢。急性毒性實驗中改良寇氏法計算LD50值為356.45 μg·kg-1·d-1。雷公藤甲素干預高、中、低劑量組的24 h尿清蛋白排泄率均較對照降低，其中高劑量組與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨蛋白尿的減少，血清清蛋白水平得到提高，HDG組較CON組血清清蛋白水平提高約2.5 g/L，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對于體質量、24 h尿量、腎臟重量、血糖、血肌酐、尿素氮、三酰甘油、膽固醇等指標，實驗組與空白對照組之間未發(fā)現差異有統(tǒng)計學意義。與此同時，病理檢查發(fā)現高劑量組的系膜面積/毛細血管襻面積和腎小球系膜擴張比例均明顯低于空白對照組(P<0.05)，中、低劑量組差異無統(tǒng)計學意義。結論100 μg·kg-1·d-1的雷公藤甲素可減少C57BL/6-Ins2Akita小鼠的蛋白尿，提高血清蛋白水平，減少系膜區(qū)系膜基質的聚積，增大劑量可能引起毒性反應。

[關鍵詞]糖尿病腎病；雷公藤屬；疾病惡化；治療結果；疾病模型,動物

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥，是導致終末期腎病的主要原因之一。預測2030年全球糖尿病的發(fā)病率將上升到7.7%[1-2]，糖尿病患者將達43 900萬，其中大約1/3會發(fā)展為DN。及早預防糖尿病腎病的發(fā)生，延緩糖尿病腎病的進展從而減少終末期腎病患者，是重大公共衛(wèi)生和社會問題。

DN 的發(fā)病機制至今仍未完全明確，多數學者認為，高血糖及糖基化終末產物、高血流動力學改變及脂肪代謝紊亂是DN病變的重要啟動因子[3]；但是，多種細胞因子和炎癥介質、趨化因子和生長因子等也可能單獨或作為上述機制的下游環(huán)節(jié)在糖尿病腎病的發(fā)展中發(fā)揮作用[4-5]。盡管經過使用血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素受體阻滯劑(ARB)、調脂藥物、抗血小板聚集等藥物，糖尿病腎病的治療效果有一定提高，但糖尿病腎病的治療沒有根本性的突破。

雷公藤是我國的一種傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、祛風通絡、舒筋活血、消腫止痛、殺蟲止血等功效。雷公藤多苷具有明顯的抗炎作用、阻斷5-羥色胺及前列腺素E2的產生，對急性滲出性和慢性增生性炎癥均有抑制作用[6-7]。能減少抗原抗體復合物沉積，誘導T細胞凋亡，抑制多種細胞因子產生和表達，從而抑制腎小球系膜細胞增生，減少尿蛋白的排出，緩解腎間質纖維化和腎小球硬化[8-9]。由于雷公藤多苷對血糖影響較小，免疫抑制作用相對溫和，國內有不少學者應用雷公藤多苷治療糖尿病腎病[10]，但研究都不夠深入。臨床上，雷公藤多苷引起肝功能損傷、腎功能下降，副作用不可小覷，糖尿病腎病患者處于哪個階段、多大劑量能夠獲益，減少蛋白尿和降低肌酐的效果是不是可以同時獲得等都是臨床上面臨的現實問題。雷公藤多苷對于糖尿病腎病的干預時機和機制都值得進一步深入研究。目前用研究的雷公藤制劑主要包括雷公藤多苷、雷公藤甲素(TP)和雷公藤紅素，雷公藤甲素是雷公藤多苷的主要作用成分，其純化物效價遠遠高于多種組分的雷公藤多苷，本研究選用雷公藤多苷為研究藥物，觀察和研究其在C57BL/6-Ins2Akita小鼠糖尿病腎病模型中的干預時機、安全性和治療作用。

1 動物與材料

1.1 實驗動物及飼養(yǎng) 2016年6月從美國 Jackson Laboratory (Bar Harbor,ME)購入10只C57BL/6-Ins2Akita基因突變雄性小鼠和40只C57BL/6野生型雌性小鼠，動物許可證號:AA1116000103。在中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所無特定病原(SPF)級動物房檢疫1月合格后飼養(yǎng)于北京大學醫(yī)學部SPF級動物房進行配對繁殖和實驗。實驗室溫度(22±1)°C，相對濕度65%～70%，12 h交替照明，飼養(yǎng)密度為2～3 只/籠(籠尺寸：30 cm×18 cm×16 cm)。自由飲食攝水，顆粒飼料喂養(yǎng)，飼料含粗蛋白24%,脂肪8%,葡萄糖20%,淀粉57%,能量16 000 kJ/kg。由于C57BL/6-Ins2Akita雌性小鼠的糖尿病腎病進展緩慢和發(fā)展不均一，選擇雄性小鼠作為研究對象[11]。C57BL/6-Ins2Akita基因突變雄鼠和C57BL/6野生型雌鼠按照1∶2配對合籠，子鼠經基因檢驗確定是否為突變型，實驗用鼠均為子一代。

1.2 主要儀器與試劑 雷公藤甲素購自中國食品藥品檢定研究院，生產批號：140726，經HPLC檢驗純度>99%，每10毫克藥品使用1 mL二甲基亞砜(DMSO)充分溶解后，用0.9%氯化鈉注射溶液配成相應濃度。血糖儀(德國Bayer公司);小鼠無創(chuàng)血壓檢測儀(美國Hatteras公司);生化檢測儀(日本Toshiba公司);小鼠尿清蛋白試劑盒(美國Invitrogen公司);二甲基亞砜(美國Amresco公司)。

1.3 方法

1.3.1 C57BL/6-Ins2Akita小鼠糖尿病腎病的評估 8周齡雄性C57BL/6-Ins2Akita小鼠和雄性C57BL/6J小鼠各8只,每4周代謝籠收集24 h尿液檢測尿微量清蛋白，眶后靜脈叢采血測定血糖、血清清蛋白、三酰甘油、膽固醇、肌酐、尿素氮。24周齡時處死小鼠，留取血液檢測上述指標，取腎臟行病理檢查。通過上述指標的對比，對C57BL/6-Ins2Akita小鼠糖尿病腎病模型進行評估以及確定雷公藤甲素干預的時機。

1.3.2 雷公藤甲素給藥14 d急性毒性實驗 8周齡C57BL/6-Ins2Akita小鼠雌雄各12只，按體質量分層隨機分為4組，每組6只，雌雄各半，四組分別按照100、200、400、800 μg·kg-1·d-1劑量給予雷公藤甲素溶液灌胃，連續(xù)灌胃14 d，給藥容量為10 mL·kg-1·d-1。實驗期間每天嚴密觀察出現的毒性反應，記錄動物外觀、活動、精神狀況、進食量、排泄物、異常分泌物、體質量變化以及死亡等情況，若動物出現死亡情況立即尸檢，發(fā)現病變器官后進一步檢查。最后根據改良寇氏法計算雷公藤甲素在8周齡C57BL/6-Ins2Akita小鼠中的LD50。急性毒性實驗用于探討雷公藤甲素在C57BL/6-Ins2Akita小鼠中的安全劑量，作為雷公藤甲素在C57BL/6-Ins2Akita小鼠中有效性實驗劑量設定的重要參考。

1.3.3 雷公藤甲素干預試驗 取24周齡雄性C57BL/6野生型小鼠8只，作為野生型對照組(WT-CON組,n=8)，24周齡雄性C57BL/6-Ins2Akita小鼠32只，依據所測得的基線24 h尿蛋白含量分層隨機分組法分為：空白對照組(CON組，n=8)，低劑量用藥組(LDG組，n=8)，中劑量用藥組(MDG組，n=8)，高劑量用藥組(HDG組，n=8)。WT-CON組和CON組以0.9%氯化鈉注射溶液灌胃，LDG、MDG、HDG組分別以25、50、100 μg·kg-1·d-1雷公藤甲素溶液灌胃，給藥容量為10 mL·kg-1·d-1。每日于下午4：00—5：00灌胃1次，連續(xù)進行2個月。實驗期間每日觀察及記錄動物的外觀、活動、精神狀況、進食量、排泄物等一般狀況，每周測量血糖和體質量，每4周代謝籠收集24 h尿液檢測尿微量清蛋白，灌胃2月后處死小鼠，處死前稱體質量，收集24 h尿液，留取血液檢測血糖、血清清蛋白、三酰甘油、膽固醇、肌酐、尿素氮，取腎臟行病理檢查。

1.3.4 血壓監(jiān)測 使用Hatteras無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)測定小鼠尾部血壓。于每天下午5：00固定時間開始測量，每只小鼠每天測量1次，系統(tǒng)每次自動測定10個循環(huán)。正式實驗開始前連續(xù)10 d對小鼠進行預測量，使小鼠熟悉測量環(huán)境。測量臺溫度保持在38 ℃，每只小鼠每次測量時間不超過25 min。

1.3.5 尿液的收集及測定 使用小鼠代謝籠收集24 h尿液，收集時間為前1日下午5：00至第2日下午5：00。收集期間正常進食飲水，量取尿液體積，3 500 r/min，4 ℃離心15 min，取上清，保存于-80 ℃冰箱。使用小鼠尿清蛋白試劑盒通過ELISA法測定尿液中清蛋白濃度，乘以體積，計算出24 h尿清蛋白排泄率(UAER)。

1.3.6 標本收集及保存 小鼠以4%水合氯醛0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉，心尖采血0.8～1.2 mL，血液于37 ℃環(huán)境下靜置30 min后，分離血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采血后剪開右心耳，從心尖處(左心室)灌注預冷的0.9%氯化鈉注射溶液，直至雙腎發(fā)白。分離腎臟包膜，取左腎上極約1/4的腎臟，放入4%多聚甲醛固定保存，留作腎臟病理檢查。

1.3.7 病理學檢查 腎臟組織石蠟包埋和切片后，行HE染色和PAS染色，分析腎小球系膜區(qū)擴張指數和系膜面積/毛細血管襻比值。HE染色切片高倍鏡(×400)下隨機選擇5個包含完整結構的腎小球，分析腎小球面積，系膜面積及毛細血管襻面積，進而得出系膜面積/毛細血管襻的比值。PAS染色切片高倍鏡(×400)下隨機選擇10個不重疊腎小球，測定系膜區(qū)擴張的程度，即腎小球損傷面積占同一腎小球總面積的百分比。計分如下：0分為正常；1分為<25%；2分為25%～50%；3分為>50%。分析軟件使用Image Pro Plus 6.0。

2 結果

2.1 C57BL/6-Ins2Akita小鼠糖尿病腎病的評估

2.1.1 一般情況對比 實驗中野生型C57BL/6J小鼠皮毛有光澤、攝食飲水情況正常、反應靈敏，活動自如。C57BL/6-Ins2Akita小鼠飲水量、進食量和尿量均明顯多于野生型小鼠(P<0.01)，并隨時間進展出現體型消瘦、毛發(fā)雜亂無光澤、反應遲鈍等表現。兩組小鼠體質量均隨周齡增長而增多，但突變型小鼠體質量增長明顯緩慢，各周齡體質量均低于野生型小鼠(P<0.01)(見圖1)。

圖1 C57BL/6-Ins2Akita小鼠與C57BL/6J野生型小鼠

2.1.2 C57BL/6-Ins2Akita小鼠與C57BL/6J野生型小鼠生化指標比較 C57BL/6-Ins2Akita小鼠自8周開始測量起血糖即明顯高于C57BL/6J野生型小鼠(P<0.01)，且隨周齡增長血糖升高較為迅速。血糖變化曲線見圖2。24 h尿清蛋白排泄率在第8周起高于野生型小鼠，但在16周測量時出現有統(tǒng)計學意義的升高(P<0.01)。同時，C57BL/6-Ins2Akita小鼠的血清清蛋白始終低于野生型小鼠(P<0.01)。兩種小鼠的多數測量指標在不同時間出現不同程度差異，見表1。

2.2 雷公藤甲素14 d急性毒性實驗 開始給藥后100 μg·kg-1·d-1和200 μg·kg-1·d-1組動物一般狀況較給藥前無明顯變化。400 μg·kg-1·d-1和800 μg·kg-1·d-1組的部分動物在給藥后出現飲食減少，活動減少，肢體發(fā)冷，體質量減輕等表現。灌胃2周后死亡數目，100 μg·kg-1·d-1和200 μg·kg-1·d-1組沒有動物死亡，400 μg·kg-1·d-1組死亡1只，800 μg·kg-1·d-1組3只全部死亡。小鼠死亡時多呈蜷縮姿勢，尸檢未見明顯異常。改良寇氏法計算LD50=356.45 μg·kg-1·d-1。

圖2 C57BL/6-Ins2Akita小鼠與C57BL/6J野生型

2.3 雷公藤甲素干預結果

2.3.1 一般狀況 不同劑量雷公藤甲素干預的各組小鼠之間一般情況未見明顯差別。實驗中動物未出現死亡。

2.3.2 雷公藤甲素對C57BL/6-Ins2Akita小鼠相關指標的影響 雷公藤甲素干預治療后，WT-CON、CON、LDG、MDG、HDG組之間24 h尿清蛋白排泄率對比(圖3)治療后LDG、MDG、HDG組的24 h尿清蛋白排泄率均較CON組降低，其中HDG組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。隨蛋白尿的減少，血漿清蛋白水平得到提高，HDG組較CON組血清清蛋白水平提高約2.5 g/L，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)。以上說明100 μg·kg-1·d-1的雷公藤甲素對C57BL/6-Ins2Akita小鼠蛋白尿的升高和血清清蛋白水平的下降有明顯的治療效果。對于體質量、24 h尿量、腎臟重量、血糖、血肌酐、尿素氮、三酰甘油、膽固醇等指標，LDG、MDG、HDG組與CON組之間的組間比較,差異無統(tǒng)計學意義(表2)。

表1 各周齡C57BL/6-Ins2Akita突變型小鼠與C57BL/6J野生型小鼠生化指標的比較

注：與同周齡野生型比較,aP<0.01,bP<0.05

注：A為WT-CON組；B為CON組；C為LDG組；D為MDG組；EHDG組；與WT-CON組比較，aP<0.01；與CON組比較，bP<0.05

圖3各組24 h尿清蛋白排泄率對比

注：A為WT-CON組；B為CON組；C為LDG組；D為MDG組；E為HDG組；與WT-CON組比較，aP<0.01；與CON組比較，bP<0.05；與MDG組比較，cP<0.05

圖4各組血清清蛋白濃度對比

2.3.3 腎組織病理學改變 HE染色結果顯示，與WT-CON組對比，CON組的系膜面積/毛細血管襻面積明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。經雷公藤甲素干預2月后，LDG、MDG、HDG組的較CON組系膜面積/毛細血管襻面積有所下降，但只有HDG組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，治療后LDG、MDG、HDG組的結果仍高于WT-CON組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3。PAS染色結果顯示，與WT-CON組對比，CON組的腎小球系膜區(qū)擴張比例為27.25%±10.51%，100 μg·kg-1·d-1雷公藤甲素灌胃治療2月后，腎小球系膜區(qū)擴張比例較CON組降低，為13.25%±6.58%，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(表3)。

3 討論

近年來，糖尿病腎病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且治療沒有根本性的突破，使得糖尿病腎病在ESRD人群中的比例越來越高，糖尿病腎病已經成為一個醫(yī)療花費巨大的社會公共衛(wèi)生問題。

由于人類樣本獲取困難，且個體差異大，DN的動物模型研究是DN研究中的重要環(huán)節(jié)，但目前還沒有找到可模擬人類DN的理想模型。國內DN研究多采用STZ誘導，但該方法造模成功率低、個體間差異大。本研究在美國Jackson實驗室引進了C57BL/6-Ins2Akita小鼠。該品種小鼠遺傳背景為C57BL/6J,為位于7號染色體的Ins2Akita等位基因突變形成自發(fā)性的雜合子糖尿病小鼠[12]，該小鼠β細胞少甚至耗盡,使胰島素分泌減少，該種小鼠是因高糖引發(fā)的DN，在致病原因上優(yōu)于STZ誘發(fā)的糖尿病腎病模型。成模成功率較高，多數鼠可發(fā)展為DN，且期間一般不會出現動物死亡現象。觀察和檢測發(fā)現，C57BL/6-Ins2Akita小鼠血糖、蛋白尿和病理表現等觀察指標變化較同步，異質性小。實驗中C57BL/6-Ins2Akita小鼠的尿蛋白水平明顯高于野生型對照組，且隨時間增長差距逐漸增大。病理檢查結果也顯示出現了和人類DN相似的系膜外基質增多等病理改變。C57BL/6-Ins2Akita小鼠用于研究DN存在一些劣勢，雖然蛋白尿出現較早，但病理改變相對不顯著，且早期不容易出現腎小球硬化。形成模型需要的時間較長，在4～6月齡才會出現輕度的病理改變，飼養(yǎng)需要耗費較多的資源。此外，C57BL/6小鼠的遺傳背景對糖尿病腎病有一定的免疫性，選用其他遺傳背景(其他品系)的Insulin-2基因缺陷小鼠模型效果可能更好[13]。

表2 各組之間相關指標的對比

表3 C57BL/6-Ins2Akita小鼠腎組織病理圖像定量分析結果

注:與WT CON組比較,aP<0.05，bP<0.01;與CON組比較,cP<0.01

C57BL/6-Ins2Akita小鼠是一個比較穩(wěn)定的I型糖尿病鼠模型，利用這個模型我們初步探討了雷公藤甲素干預的時間和劑量問題。根據急性毒性試驗計算的LD50值為356.54 μg·kg-1·d-1，根據LD50和其他研究資料選定的25、50、100 μg·kg-1·d-1三個治療劑量，最終只在100 μg·kg-1·d-1組顯示治療有效，結果顯示雷公藤甲素的治療劑量和中毒劑量比較接近，治療窗相對較窄。這點與雷公藤制劑在臨床應用中一致，劑量的選擇是雷公藤制劑治療中的重要問題。

雖然目前越來越多的研究表明，高糖、糖基化終末產物的蓄積、氧化應激等因素導致的機體免疫系統(tǒng)的過度激活和炎性因子過度釋放是DN發(fā)生和發(fā)展的關鍵原因，但目前臨床上用于糖尿病腎病的抗炎藥物甚少。雷公藤甲素對蛋白尿的治療作用在本研究中得到了驗證，經過雷公藤甲素干預的C57BL/6-Ins2Akita小鼠蛋白尿明顯下降(P<0.05)，與此同時血清清蛋白水平得到恢復(P<0.05)。病理分析結果表明，雷公藤甲素對減少糖尿病腎病的系膜基質聚積、減輕系膜擴張有作用。

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ExperimentalstudyofTripterygiumglycosidesindelayingtheprogressionofdiabeticnephropathy

FanHongru*,YangJihong,WangMeng,DuJunjie,FangFang

(*DepartmentofNephrology,PekingUniversityFifthSchoolofClinicalMedicine,BeijingHospital,NationalCenterofGerontology,Beijing100730，China)

Corresponding author:YangJihong,Email:yang1119@ymail.com

[Abstract]ObjectiveTo investigate the safe dosage of triptolide for C57BL/6-Ins2Akita mice and its effect on delaying the progression of diabetic nephropathy.MethodsThe male C57BL/6-Ins2Akita mice and C57BL/6J mice were selected in this experient,From 8weeks old they were examed blood glucose,blood pressure every 4-5 weeks,24 hour urine albumin,serum creatinine,urea,lipids and liver function were checked every 8 weeks,in order to determine the time for the occurrence and assessment of diabetic nephropathy.At the same time,we intragastrically administrated 8-week-age C57BL/6-Ins2Akita mice with 100，200，400,800 μg·kg-1·d-1for 14 days.Observing the acute toxic reactions and calculating the LD50by bliss.Based on above experiments and references,we decided to intervene 24-week-age C57BL/6-Ins2Akita mice with 25,50,100 μg·kg-1·d-1for 8 weeks.And set the blank control and wild control groups.Meanwhile,we collect urine to detect the urinary albumin excretion rate for 24 h,and urinary protein/creatinine,following by collecting the blood to detect some indexes such as the creatinine,urea nitrogen and serum albumin after killing the mice.ResultsThe level of urinary albumin excretion rate,blood sugar,triglyceride and Cholesterol in C57BL/6-Ins2Akita mice were higher than those in C57BL/6J mice at all ages(P<0.05),while the level of serum albumin was lower than that of C57BL/6J wild mice.The gap was gradually drawn apart with age increasing.However,the creatinine did not show the ascendant tendency.The value of LD50is 356.45 μg·kg-1·d-1.Compared with the control,the high,medium and low triptolide experiment groups have less urinary albumin excretion rate with a statistically significant difference in high dose group(P<0.05).Serum albumin increased following the reduction of albuminuria.The serum albumin of HDG group increased by 2.5 g/L compared with CON group,which is statistically significant(P<0.05).There was no statistically significant difference in body weight,urine amount for 24h,kidney weight,blood sugar,blood creatinine,urea nitrogen,triglyceride and cholesterol etc between experiment and control group.Meanwhile,mesangial area/capillary loop area as well as the glomerular mesangial membrane expansion rate in high dose group are obviously under the blank control group(P<0.05)while no statistically significant difference was observed in low and medium groups.ConclusionWithin safe dosages,high dose triptolide can reduce the albuminuria,alleviate accumulation of mesangial matrix and increase blood albumin in C57BL/6-Ins2Akita mice,toxic reactions are prone to occur with higher doses.

[Keywords]Diabetic nephropathies；Tripterygium；Disease progression；Treatment outcome；Disease models,animal

中圖分類號：R587.24

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2018.03.024

基金項目：國家自然科學基金(81373803)

作者簡介：范鴻儒，碩士研究生，Email:1976728022@qq.com

通信作者：楊繼紅，副教授，博士生導師，Email:yang1119@ymail.com

2018-02-23)