厚樸酚對膿毒癥大鼠模型急性肺損傷的保護作用及機制

段金旗 林 艷 趙芹芳 徐昌富 馬麗瓊

(張家口學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河北 張家口 075000)

膿毒癥是一種由致病微生物感染所引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，病情進展迅速，死亡率高，如果沒有得到及時有效的治療，會發(fā)展成為多器官功能障礙綜合征(MODS)等并發(fā)癥，其中肺臟是易受累的器官之一〔1,2〕。急性肺損傷是膿毒癥患者死亡的主要原因之一，減少膿毒癥進展過程中的急性肺損傷，對提高患者生存率具有重要意義〔3〕。厚樸酚具有抗氧化，抗菌，抗內(nèi)毒素，抗炎，抗腫瘤等藥理作用，臨床上主要用于炎癥，細菌感染等疾病的治療〔4,5〕。近些年來研究證實厚樸酚對脂多糖引起的大鼠急性肺損傷及膿毒癥所致的胃腸動力障礙具有顯著的治療或者改善作用〔6,7〕，提示厚樸酚可能對膿毒癥所導(dǎo)致的急性肺損傷可能具有改善作用，但此推測尚未見報道。本研究旨在探討厚樸酚對膿毒癥大鼠急性肺損傷的作用及相關(guān)機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 40只SD雄性大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證書：SCXK(滬)2012-0002，大鼠自由飲食和攝水。

1.2主要試劑及儀器 厚樸酚購于中國食品藥品檢定研究院；兔抗人NF-κB p65，p-NF-κB p65，IκBα，p-IκBα及GAPDH多克隆抗體均購自美國Abcam公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白細胞介素-1β(IL-1β)，IL-6，細胞間黏附分子(ICAM-1)及巨噬細胞炎癥蛋白(MIP)-2酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，黃嘌呤氧化酶(XOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測試劑盒均購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司。ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司；ELX800酶標分析儀購自美國Bio-Tek公司。

1.3建模及分組〔8,9〕40只大鼠隨機分成4組，假手術(shù)組，模型組，厚樸酚低、高劑量組(4、8 mg/kg)，每組10只。模型組及厚樸酚組均參考相關(guān)文獻方法行盲腸結(jié)扎復(fù)制膿毒癥大鼠模型，造模大鼠均存活。假手術(shù)組打開腹腔找到盲腸后縫合腹壁切口，盲腸不作結(jié)扎穿刺。厚樸酚組大鼠分別腹腔注射給予4、8 mg/kg厚樸酚，假手術(shù)組及模型組給予等量生理鹽水，連續(xù)3 d，1次/d。

1.4支氣管肺泡灌洗液(BALF)及肺組織標本的獲得 在第3天，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，結(jié)扎大鼠右支氣管，沖洗左肺支氣管肺泡，獲得肺泡灌洗液，采用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒檢測蛋白濃度，血細胞分析儀檢測總白細胞數(shù)，Kwik-Diff染色法對中性粒細胞進行計數(shù)。另外取右肺下葉組織，清洗干凈血跡，用于細胞因子及蛋白的檢測。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 4%多聚甲醛固定右肺組織標本，石蠟包埋、切片(5 μm)，于二甲苯Ⅰ、Ⅱ，70%、95%、95%、100%酒精，蒸餾水中脫蠟至水洗。蘇木素染色，鹽酸酒精分化，流水沖洗。梯度酒精脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，中性樹脂封固，于鏡下觀察。肺損傷嚴重程度評分標準：肺泡，肺間質(zhì)均正常計0分；肺泡，肺間質(zhì)輕度水腫，少量出血，少量炎性因子浸潤計1分；肺泡，肺間質(zhì)較多炎性因子浸潤，出血水腫，毛細血管淤血計2分；大量炎性因子浸潤，肺泡腔顯著出血水腫計3分。

1.6ELISA檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1及MIP-2含量 取部分右肺組織，眼科剪剪碎，勻漿機勻漿，15 000 r/min離心10 min，收集上清液，后取上清液嚴格按照TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1及MIP-2 ELISA試劑盒說明書檢測各自含量。

1.7比色法檢測MDA，SOD，XOD及GSH-Px活性 取部分右肺組織，眼科剪剪碎，勻漿機勻漿，15 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用比色法分別檢測MDA，SOD，XOD及GSH-Px活性。

1.8Western印跡檢測NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達 取右肺組織標本，勻漿機勻漿并裂解后，4℃，10 000 r/min離心10 min，收集上清液即是總蛋白，測定蛋白濃度。制作濃縮膠，分離膠，蛋白上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，后濕法轉(zhuǎn)膜。一抗溶液(兔抗NF-κB p65，p-NF-κB p65，IκBα，p-IκBα及GAPDH多克隆抗體，稀釋度均為1∶100)孵育，4℃過夜；次日于二抗溶液室溫孵育1 h。于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1厚樸酚對膿毒癥大鼠肺組織病理形態(tài)及病理評分的影響 假手術(shù)組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隙無明顯的充血水腫，有極少量的炎性細胞浸潤；模型組肺泡斷裂，肺泡間隙明顯充血水腫，并有大量炎性因子浸潤；厚樸酚組肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，有少量炎性因子浸潤。與假手術(shù)組比較，模型組病理評分顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，厚樸酚組病理評分顯著降低(P<0.01)。見表1。

2.2厚樸酚對膿毒癥大鼠BALF中蛋白含量，中性粒細胞及白細胞總數(shù)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組中蛋白含量、中性粒細胞及白細胞總數(shù)均顯著增加(P<0.01)；與模型組比較，厚樸酚低、高劑量組中蛋白含量，中性粒細胞及白細胞總數(shù)均顯著減少(P<0.01)。見表1。

表1 厚樸酚對膿毒癥大鼠BALF中蛋白含量， 中性粒細胞及白細胞總數(shù)的影響

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；下表同

2.3厚樸酚對膿毒癥大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β及IL-6含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組TNF-α、IL-1β及IL-6含量均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，厚樸酚低、高劑量組TNF-α、IL-1β及IL-6含量均顯著降低(P<0.01)。見表2。

2.4厚樸酚對膿毒癥大鼠肺組織MDA含量、SOD、XOD及GSH-Px活性的影響 與假手術(shù)組比較，模型組中MDA含量及XOD活性提高(P<0.01)，SOD及GSH-Px活性降低(P<0.01)；與模型組比較，厚樸酚低、高劑量組中MDA含量及XOD活性降低(P<0.01)，SOD及GSH-Px活性提高(P<0.01)。見表3。

2.5厚樸酚對膿毒癥大鼠肺組織ICAM-1及MIP-2含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組中ICAM-1及MIP-2含量提高(P<0.01)；與模型組比較，厚樸酚低、高劑量組中ICAM-1及MIP-2含量降低(P<0.01)。見表4。

2.6厚樸酚對膿毒癥大鼠肺組織NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 與假手術(shù)組比較，模型組中p-IκBα及p-NF-κB p65表達量上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，厚樸酚低、高劑量組中p-IκBα及p-NF-κB p65表達量下調(diào)(P<0.01)。見圖1，表4。

表2 厚樸酚對膿毒癥大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β及IL-6含量的影響

表3 厚樸酚對膿毒癥大鼠肺組織MDA含量、SOD、XOD及GSH-Px活性的影響

表4 厚樸酚對膿毒癥大鼠肺組織ICAM-1、MIP-2含量及p-IκBα、NF-κB p65表達量的影響

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：低劑量組；D：高劑量組圖1 厚樸酚對膿毒癥大鼠肺組織NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

3 討 論

研究表明，膿毒癥所導(dǎo)致的急性肺損傷，最主要的發(fā)病機制是由于機體全身的瀑布式炎癥反應(yīng)，膿毒癥發(fā)生時候，機體產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)及氧化脂質(zhì)代謝物，促使中性粒細胞、白細胞等炎癥細胞向肺組織聚集浸潤，產(chǎn)生大量的炎性因子，趨化因子，氧自由基，最終損傷肺組織〔1,10〕。厚樸酚是一種從中藥厚樸中提取出來的含有烯丙基的多酚類物質(zhì)，具有顯著的清除自由基、抗氧化作用，同時還具有顯著的抗炎作用〔4,5〕。王雪冰〔7〕研究表明，厚樸酚能顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷，與下調(diào)TNF-α、IL-1β表達有關(guān)。同時還有研究表明，厚樸酚能顯著改善膿毒癥引起的大鼠胃腸功能障礙〔6〕。從而推測厚樸酚對膿毒癥引起的急性肺損傷可能具有顯著的治療作用，且機制可能涉及厚樸酚的抗氧化及抗炎作用。

相關(guān)文獻顯示〔11〕，使用4、8 mg/kg的厚樸酚干預(yù)膿毒癥大鼠，并檢測相關(guān)指標發(fā)現(xiàn)在膿毒癥發(fā)生時，肺血管通透性增加，血管內(nèi)大量的液體進入肺泡腔，導(dǎo)致BALF中炎癥細胞數(shù)目增加的同時蛋白含量也顯著升高〔1〕。本研究結(jié)果表明，厚樸酚能顯著的降低BALF中蛋白濃度，減少中性粒細胞及白細胞數(shù)目。TNF-α是膿毒癥早期最為重要的炎癥因子，是炎癥反應(yīng)開始的觸發(fā)因子，能夠激活中性粒細胞，巨噬細胞等炎癥細胞，并使炎癥細胞釋放IL-1β及IL-6等二級炎癥因子，擴大炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加重肺組織炎癥損傷〔12〕。另外ICAM-1是細胞黏附分子家族一員，被TNF-α激活后，能與中性粒細胞表面配體結(jié)合，促使中性粒細胞向炎癥部位聚集，并激活T細胞〔10〕。MIP-2是趨化因子的一種，能夠參與白細胞的活化與遷移，促使炎癥反應(yīng)進一步加大〔10〕。本研究結(jié)果表明，厚樸酚能顯著降低TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1及MIP-2，提示厚樸酚能夠通過減少炎癥因子，趨化因子，黏附分子分泌進而抑制抑制膿毒癥引起的急性肺損傷。

XOD是黃嘌呤核苷酸的分解酶，在膿毒癥引起的急性肺損傷過程中，黃嘌呤脫氫酶變構(gòu)為XOD，并產(chǎn)生大量的氧自由基，GSH-Px是機體內(nèi)一種重要的氧自由基清除酶，能夠清除膿毒癥急性肺損傷過程產(chǎn)生的過氧化物及自由基，使肺組織避免氧化損傷；MDA是生物膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，能反映肺氧化損傷程度；SOD是機體內(nèi)重要的抗氧化物酶，能夠減輕氧自由基引起的肺損傷〔13〕。本研究結(jié)果提示厚樸酚可能通過提高機體抗氧化能力及清除自由基能力進而抑制膿毒癥引起的大鼠急性肺損傷。

NF-κB是一種與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子，炎癥因子TNF-α、IL-1β及IL-6能夠結(jié)合于特異性-κB位點，激活NF-κB信號通路〔14〕。NF-κB包含5個亞基，其中p65最為重要，在靜息狀態(tài)下，與IκB蛋白形成二聚體存在于細胞質(zhì)中，在受到上游炎癥信號刺激后，IκB被激活，并磷酸化，使p65釋放出來進入細胞核，調(diào)控多種炎性相關(guān)因子表達，如趨化因子，黏附分子，細胞因子等〔14〕。厚樸酚能夠顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的人肺上皮細胞炎癥反應(yīng)，與抑制NF-κB信號通路繼而降低ICAM-1表達有關(guān)〔15〕。本研究結(jié)果說明厚樸酚可能通過抑制NF-κB信號通路激活，發(fā)揮抗炎、抗氧化作用，最終抑制膿毒癥引起的大鼠急性肺損傷。

綜上所述，厚樸酚能顯著改善膿毒癥大鼠肺組織結(jié)構(gòu)，減少炎癥細胞浸潤， 降低TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1、MIP-2、MDA含量及XOD活性，提高SOD及GSH-Px活性，最終抑制膿毒癥引起的大鼠急性肺損傷，其機制可能與阻斷NF-κB信號通路有關(guān)。

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