Hedgehog信號通路抑制劑對轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)人膽管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

曲義坤 國麟祺 陳 剛 徐 劍 程卓鑫

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，黑龍江 佳木斯 154000)

膽管癌侵襲能力及轉(zhuǎn)移能力都很強，在早期就容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔1〕。目前治療此疾病的最有效方法是根治性手術(shù)，但大多數(shù)患者就診時便失去了手術(shù)的機會。與此同時，膽管癌對放化療不敏感，因此，臨床上患者的5年生存率較低，且預(yù)后較差〔2〕。有學(xué)者提出，膽管細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)是其侵襲轉(zhuǎn)移前的主要步驟，而轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1因子是誘發(fā)EMT形成的最主要的因素〔3〕。本研究分析Hedgehog信號通路抑制劑對TGF-β1誘導(dǎo)人膽管癌細(xì)胞(RBE)生物學(xué)行為的影響。

1 資料與方法

1.1材料與試劑 肝膽管癌細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)、Hedgehog信號通路信號抑制劑環(huán)杷明(Selleckchem)、TGF-β1誘導(dǎo)劑(Selleckchem)、RPMI1640(Transgenbiotech)、優(yōu)質(zhì)的胎牛血清(HyClone)

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將購買的10%新鮮的胎牛血清融入RPMI1640培養(yǎng)基，而后對人膽管癌細(xì)胞(RBE)進行接種，待接種完全后，將培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境要求溫度設(shè)定為37℃，CO2的濃度為5%，保持周圍環(huán)境的清潔。細(xì)胞培養(yǎng)期間一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡，立即停止實驗，并重新開始。當(dāng)細(xì)胞處于成對數(shù)生長期時，選取細(xì)胞進行實驗，并用TGF-β1誘導(dǎo)RBE細(xì)胞增殖。

1.3加入環(huán)杷明溶液，并對其行細(xì)胞計數(shù)法檢測 對上述收集的細(xì)胞進行觀察，確定選擇細(xì)胞健康存活且處于呈對數(shù)生長期。將其接種于6孔板上，其密度要求為1×104/cm2。此時，配置5、10、15、20、40 μmol/L的不同濃度的環(huán)杷明溶液。觀察細(xì)胞生長情況，待到融合度為75%左右，加入不同濃度的環(huán)杷明溶液。隨后用胰酶處理6孔板內(nèi)的細(xì)胞，并選用臺盼藍(lán)進行染色處理，根據(jù)所顯現(xiàn)的顏色，進行計數(shù)，隨后計算活細(xì)胞率。而后，選擇濃度為20 μmol/L的環(huán)杷明溶液為不變量，將培養(yǎng)時間為可變量，分別為1、2、3 d，隨后采用上述方法，計算活細(xì)胞比率。

1.4檢測環(huán)杷明溶液對RBE活性的影響 首先，先用胰酶處理細(xì)胞，將其制作成細(xì)胞懸濁液，濃度要求為5.5×107/L，隨后接種至含96的孔板上。加入不同濃度的環(huán)杷明溶液，操作同1.3。將不加入環(huán)杷明溶液的一組作為空白對照組進行實驗，其余操作同實驗組。選用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5二苯基四氮唑嗅鹽(MTT)法來檢測Hedgehog信號通路抑制劑環(huán)杷明對REB的活力影響。隨后選用MTT法檢測環(huán)杷明對REB增殖的影響，以抑制率為指標(biāo)進行判斷。抑制率的計算方式為：抑制率(%)=〔1-(實驗組吸光度-空白組吸光率)/(對照組的吸光率-空白組的吸光率)×100%〕〔4〕。吸光率使得測定設(shè)定的酶標(biāo)儀的波長為490 nm。而后，固定環(huán)杷明的濃度為20%，將時間作為變量(1、2、3 d)，用上述方法，計算抑制率。

1.5Western印跡法測定 采用Western印跡法測定RBE產(chǎn)生的Glil蛋白及Smo蛋白的表達(dá)數(shù)量。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件行χ2、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1環(huán)杷明對RBE的影響 經(jīng)過環(huán)杷明處理過的RBE放置差相倒置顯微鏡下進行觀察，鏡下結(jié)果顯示，REB的生長速度明顯減緩，且細(xì)胞體積較不處理的細(xì)胞變小，形態(tài)更圓；其余的結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，例如：細(xì)胞間的連接較正常細(xì)胞減少，少數(shù)甚至消失，大部分細(xì)胞由于脫水導(dǎo)致皺縮、細(xì)胞核固縮現(xiàn)象出現(xiàn)，這說明經(jīng)環(huán)杷明的處理，對RBE產(chǎn)生了破壞〔5,6〕。此外，隨時間的延長，這種現(xiàn)象也更為明顯(見圖1)。而經(jīng)處理后的RBE，經(jīng)過臺盼藍(lán)染色計數(shù)、經(jīng)MTT法檢測抑制率，結(jié)果顯示，濃度為5、10、15、20、40 μmol/L的環(huán)杷明都可以通過調(diào)控Hedgehog信號通路而對REB的活性及增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用，且與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而控制環(huán)杷明的濃度，將時間作為變量的實驗中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)環(huán)杷明處理時間越長，RBE的生長能力越弱(P<0.05)，見表1、表2。

圖1 差相倒置顯微鏡下RBE的形態(tài)(×200)

項目空白對照組環(huán)杷明5 μmol/L10 μmol/L15 μmol/L20 μmol/L40 μmol/L細(xì)胞增殖率100801)621)581)441)301)細(xì)胞抑制率0311)521)491)511)611)

與空白對照組比較：1)P<0.05

表2 不同作用時間環(huán)杷明對RBE增殖和抑制的影響(%)

與0 h比較：1)P<0.05；表3同

2.2環(huán)杷明對RBE表達(dá)蛋白Glil和Smo的影響 不經(jīng)過環(huán)杷明處理過的RBE表達(dá)的Glil及Smo的數(shù)量較高，而經(jīng)過環(huán)杷明處理后的REB所翻譯出兩種蛋白質(zhì)的量皆有所減少(P<0.05)；而且隨著環(huán)杷明處理的時間越長，其表達(dá)數(shù)量越低(P<0.05)，見表3。

表3 環(huán)杷明處理不同時間對RBE表達(dá)蛋白Glil和Smo影響

3 討 論

膽管癌的癌變細(xì)胞主要是肝內(nèi)膽管的上皮細(xì)胞。當(dāng)前，最主要、最有效的治療方法為手術(shù)根治切除術(shù)。然而，由于其轉(zhuǎn)移時間早、侵襲性強。所以傳統(tǒng)的手術(shù)治療后，其預(yù)后效果較差，而5年生存率也仍舊較低〔7,8〕。近年來，膽管癌的發(fā)病率持續(xù)增高，治療此疾病的關(guān)鍵是早期診斷和治療〔9〕。經(jīng)查閱資料〔10〕發(fā)現(xiàn)，Hedgehog信號通路、TGF-β、Notch對腫瘤的發(fā)生具有促進作用。

在某些因素的作用下，如感染、重度、創(chuàng)傷，上皮細(xì)胞可以發(fā)生化生作用，由其原本的形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維樣細(xì)胞的形態(tài)〔11〕。這就使得細(xì)胞的極性喪失，并且細(xì)胞間的連接明顯減弱，這就使得癌細(xì)胞的遷移及侵襲的能力增強。從而使細(xì)胞獲得了間質(zhì)細(xì)胞所具有的形態(tài)和特性，這種變化將其稱之為EMT〔12〕。而EMT的主要特點就是上皮細(xì)胞極性的喪失和具有間質(zhì)特殊性的獲得。這一變化，是腫瘤早期轉(zhuǎn)移的主要原因。在EMT的過程中，上皮細(xì)胞所表達(dá)的E-聯(lián)環(huán)素、a-聯(lián)環(huán)素、p-聯(lián)環(huán)素水平下調(diào)〔13〕。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT是癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的必要條件。研究〔14〕發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可以誘導(dǎo)RBE增殖。

Hedgehog信號通路在人類的早期器官的發(fā)育及發(fā)育成熟后的組織修護中有高度的保守性，這就對維護機體器官、組織甚至細(xì)胞的正常狀態(tài)起到了重要的作用〔15〕。此信號通路只有在其受體與配體結(jié)合后才能被激活，激活后的Hedgehog信號通路可以解除對Smo的抑制作用，隨后，Smo具有激活Glil的作用，激活的Glil可以被轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核，而后目的靶基因被激活發(fā)生轉(zhuǎn)錄，從而對染色的形成、細(xì)胞周期的活動，甚至對細(xì)胞的生長、運動、凋亡都起到調(diào)節(jié)作用〔16〕。有研究〔17〕證明，很多腫瘤的發(fā)生，如結(jié)腸癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、食管癌都與Hedgehog信號通路的激活關(guān)系密切。因此，特異性阻斷劑環(huán)杷明可以通過阻斷Hedgehog信號通路而抑制細(xì)胞反應(yīng)。

環(huán)杷明的作用機制主要是在作用于Smo后抑制通路的活性。而它并不屬于全身性的化療藥物，因此，用其治療，對患者機體其他的組織器官并不會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用〔18〕。而Glil是位于Smo下游的一個因子，有著承上啟下的調(diào)控作用。本研究與以往的相關(guān)研究〔19〕有著高度的一致性。本研究結(jié)果說明經(jīng)環(huán)杷明的處理，對RBE細(xì)胞產(chǎn)生了破壞。此外，隨時間的延長，這種現(xiàn)象也更為明顯。本研究結(jié)果表明，環(huán)杷明可以很好地抑制RBE增殖，且這種關(guān)系有著劑量依賴性和時間依賴性。Hedgehog信號通路具有維持RBE增殖的作用，要想治療膽管癌細(xì)胞可以考慮阻斷這一信號通路。這與Thayer等〔20〕在胰腺癌得到的結(jié)論不謀而合。造成這一現(xiàn)象的機制可能是由于環(huán)杷明可以通過對抗Smo進一步控制Clil，Clil直接使血小板源性生長因子受體(PDGF)Rα及B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl)-2的表達(dá)降低，而凋亡細(xì)胞因子(Fas)和死亡受體(DR)5的表達(dá)升高。FAS及DR5都具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性，而Bcl-2可以經(jīng)由多種途徑進行調(diào)控，從而促進凋亡。以此推測，環(huán)杷明在抑制細(xì)胞增殖的過程可能與促進細(xì)胞凋亡的過程相互影響。

綜上，環(huán)杷明作為特異性抑制劑可以通過阻斷Hedgehog信號通路而對TGF-β1誘導(dǎo)的RBE細(xì)胞生物學(xué)行為學(xué)產(chǎn)生影響，主要可以抑制其增殖，其發(fā)生機制可能與抑制Glil及Smo蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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