慢病毒介導(dǎo)siRNA干擾尿路上皮癌相關(guān)基因1表達(dá)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549惡性行為的影響

孫 莉 郭 穎 楊紅蘭

(勝利石油管理局勝利醫(yī)院腫瘤科，山東 東營(yíng) 257055)

肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的主要病理類(lèi)型，占全部肺癌的50%以上〔1〕。絕大多數(shù)肺腺癌患者為周?chē)头伟?，早期癥狀輕，影像學(xué)特征不明顯，且較易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移〔2,3〕。研究顯示，尿路上皮癌相關(guān)基因(UCA)1參與包括膀胱癌、乳腺癌及結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔4〕，但其對(duì)肺腺癌細(xì)胞惡性行為的影響及相關(guān)機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)慢病毒體外介導(dǎo)靶向UCA1的小干擾RNA(siRNA)下調(diào)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中UCA1的表達(dá)，探究其對(duì)細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移能力及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)程的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：包括人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H358、H1299、H460、人支氣管上皮細(xì)胞系HBE及人腎上皮細(xì)胞系HEK293T(美國(guó)ATCC)。實(shí)驗(yàn)儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo，3111)、超凈工作臺(tái)(美國(guó)Thermo，Heraguard ECO 1.2)、低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma，3-18K)、PCR基因擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad，S1000)、超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo，SMA2000)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems，7500)、酶標(biāo)儀(北京普天，PT-3502)、光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica，DM1000)、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)。實(shí)驗(yàn)材料：DMEM及RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Hyclone)、轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipofectamine 3000(美國(guó)Thermo)、慢病毒包裝載體(pLP1,pLP2,pLP VSV-G，美國(guó)addgene)及慢病毒目的載體(pDECKO-UCA1,pDECKO-blank、美國(guó)addgene)、嘌呤霉素(美國(guó)Sigma)、RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Sybr Green熒光染料(日本Takara)、MTS試劑盒(美國(guó)Promega)、基質(zhì)膠(美國(guó)BD Biosciences)、IP裂解液及蛋白酶抑制劑(上海生工)、E-鈣黏蛋白(cadherin)抗體(美國(guó)Sigma，SAB4503751)、波形蛋白(Vimentin)(美國(guó)Sigma，SAB4503083)、GAPDH(美國(guó)Sigma，G9545)、羊抗兔IgG(美國(guó)Sigma，RC05011A)、電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒(美國(guó)Thermo)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人肺腺癌細(xì)胞系及人支氣管上皮細(xì)胞系均使用RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清，人腎上皮細(xì)胞系使用DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清，培養(yǎng)于37℃，5%CO2生化培養(yǎng)箱中，超凈工作臺(tái)中進(jìn)行嚴(yán)格無(wú)菌操作。慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建干擾組及對(duì)照組細(xì)胞：接種HEK293T細(xì)胞于六孔板中，取2支1.5 ml離心管加入1 ml DMEM培養(yǎng)基，均加入1.00 μg pLP1、0.50 μg pLP2、0.75 μg pLP VSV-G各病毒包裝載體，分別加入2 μg pDECKO-UCA1載體及pDECKO-blank載體，室溫靜置10 min，均加入10 μl 轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體，混勻后靜置30 min，滴加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞中，保證培養(yǎng)基總體積為2 ml，4 h后更換DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清液(病毒懸液)并過(guò)濾，1∶1與RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清混合培養(yǎng)A549細(xì)胞3 d，1 μg/ml嘌呤霉素篩選細(xì)胞7 d，完成干擾組及對(duì)照組細(xì)胞系的構(gòu)建。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中UCA1的表達(dá) 收集1×105個(gè)干擾組及對(duì)照組細(xì)胞，以及人肺腺癌細(xì)胞系及人支氣管上皮細(xì)胞系，1 ml RNA提取試劑重懸，進(jìn)行細(xì)胞總RNA的抽提，超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的含量，1 μg 總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA模板用DEPC水稀釋至500 μl，引物稀釋至20 nmol/μl，相關(guān)序列如下：UCA1上游引物：5′-CTCTCCATTGGGTTCACCATTC-3′，下游引物5′-GCGGCAGGTCTTAAGAGATGAG-3′；GAPDH上游引物：5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′，下游引物5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′，按10 μl Sybr Green熒光染料體系上樣，設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，ABI 7500系統(tǒng)分析每個(gè)上樣孔的熒光強(qiáng)度，以GAPDH為內(nèi)參基因，2-△△CT法計(jì)算UCA1的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖能力 將干擾組及對(duì)照組細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種至96孔板中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。在0、12、24、48及72 h將MTS試劑與RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清培養(yǎng)基1∶5混合均勻，替換原有培養(yǎng)基，生化培養(yǎng)箱中靜置1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)樣本490 nm處吸光度，兩組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)的吸光度與0 h的吸光度的比值作為衡量細(xì)胞相關(guān)增殖能力的依據(jù)。

1.2.4Transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞侵襲遷移能力 稀釋基質(zhì)膠至50 mg/L，將Transwell小室置于24孔板中，取100 μl 基質(zhì)膠加入Transwell小室膜中央，生化培養(yǎng)箱中放置6 h，無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基水化基底膜30 min，無(wú)血清RPMI1640重懸干擾組及對(duì)照組細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×105/ml，取200 μl(細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè))加至上小室，下小室加入500 μl RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h作為T(mén)ranswell侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?；另取未加入基質(zhì)膠的Transwell小室置于24孔板中，同樣加入200 μl上述細(xì)胞懸液，下小室加入500 μl RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清，作為T(mén)ranswell遷移實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。無(wú)水乙醇固定細(xì)胞10 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，棉簽拭去上室面細(xì)胞，PBS洗上室面3次，100倍光鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，隨機(jī)取中間和四周5個(gè)視野，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.5Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞E-cadherin及Vimentin的表達(dá) 收集1×106個(gè)干擾組及對(duì)照組細(xì)胞，500 μl IP裂解液+蛋白酶抑制劑重懸細(xì)胞，4℃裂解細(xì)胞1 h，4℃離心細(xì)胞10 min，取細(xì)胞上清液BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，配置30 μg上樣體系，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白100 V轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，1∶500 E-cadherin抗體(135 kD)、Vimentin抗體(60 kD)、GAPDH抗體(37 kD)室溫孵育相應(yīng)蛋白條帶2 h，1∶2 000二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液曝光顯影，掃描條帶灰度值，將E-cadherin及Vimentin與相應(yīng)GAPDH的比值作為衡量E-cadherin及Vimentin表達(dá)的依據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件，兩組計(jì)量資料比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組計(jì)量資料比較采用方差分析，SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié) 果

2.1肺腺癌細(xì)胞系與支氣管上皮細(xì)胞系UCA1表達(dá)的比較 A549、H358、H1299、H460中UCA1的表達(dá)量分別為(0.279±0.024)、(0.146±0.017)、(0.185±0.011)、(0.216±0.025)，均顯著高于HBE中UCA1的表達(dá)量(0.082±0.009)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.330，P<0.01，兩兩比較：A549與HBE相比，q=13.827，P<0.01；H358與HBE相比，q=3.601，P<0.05；H1299與HBE相比，q=6.653，P<0.01；H460與HBE相比，q=8.143，P<0.01)。

2.2兩組細(xì)胞UCA1表達(dá)的比較 干擾組UCA1的表達(dá)量(0.065±0.008)顯著低于對(duì)照組(0.263±0.028，t=9.171，P<0.01)，干擾效率為73.2%。

2.3兩組細(xì)胞增殖能力的比較 干擾組48及72 h細(xì)胞增殖能力顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組細(xì)胞各時(shí)間增殖能力的比較

2.4兩組細(xì)胞E-cadherin及Vimentin表達(dá)的比較 干擾組細(xì)胞E-cadherin相對(duì)表達(dá)量為(0.630±0.113)，顯著高于對(duì)照組細(xì)胞(0.371±0.086，t=3.159，P<0.01)；干擾組細(xì)胞Vimentin相對(duì)表達(dá)量為(0.124±0.036)，顯著低于對(duì)照組細(xì)胞(0.295±0.061，t=4.217，P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 兩組細(xì)胞E-cadherin及Vimentin表達(dá)的比較

2.5兩組細(xì)胞侵襲及遷移能力比較 干擾組侵襲細(xì)胞數(shù)為(59.3±7.9)，顯著少于對(duì)照組細(xì)胞數(shù)(92.8±10.2；t=3.681，P<0.01)；干擾組遷移細(xì)胞數(shù)為(64.6±8.5)，顯著少于對(duì)照組細(xì)胞數(shù)(107.3±13.0；t=4.720，P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 兩組細(xì)胞侵襲及遷移能力的比較(×100)

3 討 論

UCA1屬于長(zhǎng)鏈非編碼RNA中的一員，不編碼相應(yīng)蛋白，但卻通過(guò)表觀遺傳及轉(zhuǎn)錄修飾等機(jī)制調(diào)控機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育〔5〕。近年有研究顯示，UCA1不僅高表達(dá)于哺乳動(dòng)物的胚胎組織中，且在多種惡性腫瘤中表達(dá)重新上調(diào)，并影響腫瘤細(xì)胞的惡性行為：①膀胱癌：Wang等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)UCA1在膀胱癌組織及胚胎組織中表達(dá)顯著上調(diào)，且可在體外促進(jìn)細(xì)胞增殖及侵襲能力；Fan等〔7〕的研究顯示UCA1可通過(guò)介導(dǎo)Wnt信號(hào)通路促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療抵抗；Xue等〔8〕對(duì)UCA1促膀胱癌增殖轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)UCA1可通過(guò)激活has-miR-145-ZEB1/2-FSCN1通路發(fā)揮促癌作用。②乳腺癌：Tuo等〔9〕在乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)UCA1表達(dá)相比正常乳腺組織顯著上調(diào)，并確定其可通過(guò)調(diào)控微小RNA-143(miR-143)的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制凋亡的生物學(xué)作用；Liu等〔10〕的研究證實(shí)了UCA1對(duì)乳腺癌細(xì)胞他莫昔芬耐藥的促進(jìn)作用。③結(jié)直腸癌：Han等〔11〕的研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中UCA1表達(dá)上調(diào)，且可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程及抑制細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；Bian等〔12〕發(fā)現(xiàn)UCA1不僅可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，且可通過(guò)抑制miR-204-5p的表達(dá)，介導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞5-氟尿嘧啶抵抗的發(fā)生。④胃癌：Shang等〔13〕在胃癌組織中同樣發(fā)現(xiàn)UCA1的高表達(dá)，通過(guò)siRNA下調(diào)胃癌細(xì)胞UCA1的表達(dá)后，細(xì)胞增殖及表阿霉素抵抗能力均顯著下降。⑤肝細(xì)胞癌：Wang等〔14〕同樣在肝細(xì)胞癌組織中檢測(cè)到UCA1表達(dá)上調(diào)，且UCA1的表達(dá)與患者TNM分期及轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)，體外UCA1可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)1的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞惡性行為的發(fā)生。⑥肺癌：Wang等〔15〕在非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織及血清中發(fā)現(xiàn)UCA1的相對(duì)高表達(dá)，且其表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；Nie等〔16〕體外干擾肺癌細(xì)胞UCA1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力顯著下調(diào)。上述研究均提示，UCA1在多種惡性腫瘤中發(fā)揮著重要的促癌作用，但目前關(guān)于UCA1對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)慢病毒介導(dǎo)siRNA干擾肺腺癌細(xì)胞UCA1的表達(dá)后，觀察細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移能力的變化，明確了UCA1對(duì)肺腺癌細(xì)胞惡性行為的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，UCA1在不同的肺腺癌細(xì)胞系中表達(dá)均顯著上調(diào)，提示其可能參與促進(jìn)正常支氣管細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化導(dǎo)致肺腺癌的發(fā)生過(guò)程。本文選擇UCA1高表達(dá)的A549細(xì)胞系構(gòu)建了慢病毒介導(dǎo)的siRNA體外干擾模型，發(fā)現(xiàn)干擾UCA1的表達(dá)后，A549細(xì)胞增殖及侵襲遷移能力均顯著下調(diào)，從反面證實(shí)了UCA1對(duì)肺腺癌細(xì)胞惡性行為的促進(jìn)作用。EMT是上皮來(lái)源惡性腫瘤的標(biāo)志性特征，E-cadherin及Vimentin作為其重要的標(biāo)志物，在EMT進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用：E-cadherin是維持上皮細(xì)胞間緊密連接的重要分子，細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化時(shí)其表達(dá)往往下調(diào)，標(biāo)志著細(xì)胞活動(dòng)及侵襲能力增強(qiáng)〔17〕，而Vimentin在惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，標(biāo)志著細(xì)胞活動(dòng)性增強(qiáng)〔18〕。本研究顯示下調(diào)A549細(xì)胞UCA1的表達(dá)后，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，Vimentin表達(dá)下調(diào)，提示UCA1對(duì)肺腺癌細(xì)胞EMT進(jìn)程的促進(jìn)作用。

綜上所述，本研究明確了UCA1可通過(guò)介導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞EMT進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移。接下來(lái)的研究中，我們將通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確UCA1通過(guò)何種方式影響肺腺癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程，并通過(guò)動(dòng)物模型明確UCA1對(duì)肺腺癌移植瘤及體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響，為揭示UCA1對(duì)肺腺癌發(fā)生發(fā)展的確切作用并指導(dǎo)相關(guān)臨床診治工作提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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