狼瘡小鼠模型中ZBTB20、Blimp1的表達(dá)變化及其意義

朱 峰 裴 露 王婷婷 胡文壇 劉紅春

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種病變累及腎臟、皮膚、肺臟等多器官的慢性自身免疫性疾病，主要以B細(xì)胞的多克隆增殖產(chǎn)生過量自身免疫球蛋白為特點(diǎn)，病情緩解和活動(dòng)交替出現(xiàn)。鋅指蛋白ZBTB20、Blimp1參與調(diào)控免疫細(xì)胞的增殖、分化、調(diào)節(jié)長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞增殖并促進(jìn)免疫球蛋白的分泌〔1〕。本研究采用免疫組化和熒光定量PCR技術(shù)對(duì)兩種狼瘡小鼠模型和正常對(duì)照小鼠模型中ZBTB20 、Blimp1的表達(dá)情況進(jìn)行試驗(yàn)分析，探究ZBTB20、 Blimp1的表達(dá)變化及其意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 MRL/lpr狼瘡小鼠(12 w、25 w)、NZB/WF1狼瘡小鼠(12 w、25 w)各10只為試驗(yàn)組，均購(gòu)南京軍區(qū)動(dòng)物試驗(yàn)中心，雌性C57BL/6正常小鼠10只(12 w、25 w)為對(duì)照組，購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。鼠抗ds-DNA抗體酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒、鼠免疫球蛋白(Ig)G ELISA試劑盒均購(gòu)自上海生工生物公司，兔抗鼠ZBTB20抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自中衫金橋生物技術(shù)有限公司，組織RNA提取試劑盒、RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自takara公司。

1.2ELISA 分別取試驗(yàn)組、對(duì)照組共30只小鼠適量血清，加樣、加標(biāo)記抗體、洗板、加入標(biāo)記的辣根過氧化物酶、洗板、顯色、終止反應(yīng)、多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)值，得出抗雙鏈DNA抗體、IgG的含量。

1.3免疫組化法(IHC) 30只小鼠分別取材后，經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片、組織脫水、切片二甲苯脫蠟、抗原修復(fù)，標(biāo)志物為ZBTB20，滴加一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)室溫顯色，用光學(xué)顯微鏡觀察染色結(jié)果。從試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的脾臟、胸腺和淋巴結(jié)任取3個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞占的比例來計(jì)算陽性率，ZBTB20陽性細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色，陰性細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)紫色。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR) 提取總RNA研磨各組織。按照說明書使用Trizol法提取各樣品總RNA。提取完畢后制備瓊脂糖凝膠，對(duì)樣本進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析比較5S 、18S及28S處條帶，使用微量分光光度儀測(cè)定核酸濃度及純度，將電泳條帶清晰完整、并且OD260/280在1.8～2.1的樣本用于后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，剩余樣品于-80℃?zhèn)浯妗Ｄ孓D(zhuǎn)錄反應(yīng)取cDNA 試劑盒，室溫放置解凍后離心，于每個(gè)反應(yīng)管中加入5×gDNA Eraser緩沖液2.0 μl、gDNA Eraser 1.0 μl、加入適量的樣本并保證每個(gè)反應(yīng)管中總RNA含量小于1 μg、加入RNase Free dH2O使得總體積達(dá)到10 μl，混勻后于42℃反應(yīng)2 min，以去除DNA。然后向上一步的反應(yīng)管中加入RNase Free dH2O 4.0 μl、5×PrimeScript緩沖液(for Real Time)4.0 μl、Prime Script RT Enzyme MixⅠ1.0 μl、RT Prime Mix 1.0 μl，混勻后于37℃反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 s，cDNA制備完成后放于-20℃暫存。

PCR引物設(shè)計(jì)與檢驗(yàn)：從NCBI的GenBank網(wǎng)頁(yè)中搜索鼠ZBTB20、Blimp-1全長(zhǎng)序列基因，使用GAPDH為內(nèi)參基因。設(shè)計(jì)引物模板后，在BLAST中查詢比較，選擇最優(yōu)引物并由上海生工公司合成，合成的引物如下：鼠ZBTB20序列：正義鏈：5′-CAGCCAAACAG-ACTACGTCA-3′，反義鏈:5′-GCATCACCATGTGCTT GATA-3′；鼠Blimp1序列：正義鏈：5′-TTCTTGTGTGGTATTGTCGGGACTT-3′，反義鏈：5′-TTGGGGACACTC-TTTGGGTAGAGTT-3′ ；鼠GAPDH參照序列：正義鏈：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，反義鏈：5′-CTCGC-TCCTGGAAGATGGTG-3′。

RT-PCR反應(yīng)：取PCR試劑盒解凍離心，向每個(gè)反應(yīng)管中加入U(xiǎn)ltraSYBR混合物(2倍ROX)10 μl、前向引物(10 μmol/L)反向引物(10 μmol/L)各1.0 μl、RNase Free dH2O 6 μl、上述合成的模板cDNA 2 μl，短暫離心，之后放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，1個(gè)循環(huán)；變性95℃15 s，60℃退火延伸1 min，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；65℃至95℃繪制溶解曲線，使用2-△△Ct法計(jì)算所測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清相關(guān)抗體檢測(cè)對(duì)比 培養(yǎng)至發(fā)病嚴(yán)重期的試驗(yàn)組小鼠脾臟明顯的腫大，腹部淋巴結(jié)及胸腺等免疫器官或組織都有不同程度的腫大，抗dsDNA抗體和IgG 在試驗(yàn)組血清中的含量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明構(gòu)建的狼瘡小鼠符合試驗(yàn)要求，見表1。

表1 小鼠血清免疫學(xué)指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；下表同

2.2兩組脾臟、胸腺和淋巴結(jié)免疫組化對(duì)比 試驗(yàn)組脾臟中，MRL/lpr小鼠陽性率22.4%，而NZB/WF1小

鼠陽性率41.5%。試驗(yàn)組的陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組(5.2%，P<0.05)，且NZB/WF1小鼠脾臟中ZBTB20陽性表達(dá)率顯著高于MRL/lpr小鼠(P<0.05)。淋巴結(jié)及胸腺中MRL/lpr小鼠ZBTB20陽性表達(dá)率(13.4%、16.5%)、NZB/WF1小鼠(11.7%、15.2%)與對(duì)照組(10.2%、14.7%)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

2.3兩組脾臟、胸腺和淋巴結(jié)ZBTB20、Blim1 mRNA相對(duì)表達(dá)量對(duì)比 淋巴結(jié)、胸腺中試驗(yàn)組和對(duì)照組結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；試驗(yàn)組兩種鼠脾臟中ZBTB20、 Blimp1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

圖1 小鼠胸腺、淋巴結(jié)免疫組化觀察(DAB，×100)

組別淋巴結(jié)ZBTB20 Blimp1 胸腺ZBTB20 Blimp1 脾臟ZBTB20 Blimp1 試驗(yàn)組 MRL/lpr鼠1.354±0.8521.653±1.3201.654±0.9521.453±0.9202.354±1.9321)3.825±2.1322) NZB/WF1鼠1.175±1.0391.612±1.3351.435±1.1391.635±1.1353.425±2.1391)3.915±1.9312)對(duì)照組 1.131±0.9541.427±0.9821.431±0.9141.577±1.0820.731±0.6140.622±0.602

3 討 論

SLE主要病理改變是出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)與血管異常，全身產(chǎn)生超過100種自身抗體〔2〕。其中，B細(xì)胞可分化為短壽命漿細(xì)胞和長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞，目前大多數(shù)靶向藥物僅能清除可分裂的B淋巴細(xì)胞，而無法清除長(zhǎng)壽命漿細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗體，這可能會(huì)導(dǎo)致SLE病情反復(fù)發(fā)作，因此，找到與SLE發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的物質(zhì)改變有利于加深我們對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)〔3〕。

ZBTB20是鋅指蛋白家族中的一種，又叫樹突細(xì)胞來源的POZ鋅指蛋白，鋅指蛋白家族成員在N端處有一個(gè)典型的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域，可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用;而位于C 端的數(shù)個(gè)C2H2結(jié)構(gòu)域可以與DNA 序列結(jié)合〔4〕。ZBTB20可以通過調(diào)控免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生異常的體液免疫反應(yīng)，從而參與到自身免疫性疾病的發(fā)病當(dāng)中。曾有人對(duì)上千例SLE患者進(jìn)行易感基因篩查，發(fā)現(xiàn)了ZBTB20是SLE的新的易感基因〔5〕。同時(shí)有實(shí)驗(yàn)表明，狼瘡小鼠脾臟中的ZBTB20 mRNA含量較對(duì)照組明顯升高，提示ZBTB20與 SLE高度相關(guān)性〔6〕。Blimp1是一種包含5個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和PR結(jié)合區(qū)的蛋白，由prdm1基因表達(dá)，是誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞向漿細(xì)胞分化的主調(diào)控子，Blimp1也是SLE的一種易感基因〔7〕。有研究表明，在SLE小鼠模型的脾臟、淋巴結(jié)、肝臟、腎臟等組織中Blimp1表達(dá)增加〔8〕，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。同時(shí)有研究顯示IRF4-ZBTB20-Blimp1通路在調(diào)控B細(xì)胞的分化成熟及誘導(dǎo)分泌抗體中發(fā)揮重要作用。

有研究表明，NZB/WF1狼瘡小鼠的長(zhǎng)壽漿細(xì)胞主要集聚于脾臟中且Blimp1表達(dá)的增加伴隨著長(zhǎng)壽漿細(xì)胞及抗體的增加〔9〕，但Blimp1是否參與并影響B(tài)淋巴細(xì)胞向長(zhǎng)壽漿細(xì)胞的分化，以及ZBTB20、Blimp1通過何種機(jī)制參與SLE的發(fā)生、發(fā)展當(dāng)中，目前仍不清楚。

綜上所述，狼瘡小鼠脾臟中Blimp1與ZBTB20高表達(dá)，可能與SLE的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

4 參考文獻(xiàn)

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