禽腺病毒4型實時熒光PCR檢測方法的建立與應用

楊金興，張玉霞，李 莉，袁小遠(山東省農(nóng)業(yè)科學院 家禽研究所，山東 濟南 250023)

禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AV)根據(jù)抗原性差異可以分為3個群，其中Ⅰ群是傳統(tǒng)的禽腺病毒，包括從雞分離到的12個血清型、火雞2個血清型、鵝3個血清型和鴨2個血清型[1-2]。禽腺病毒可以引起禽包涵體肝炎、心包積液、肌胃糜爛等病變。自2015年6月起，山東省部分地區(qū)的肉雞中爆發(fā)了一種以傳染速度很快、死亡速度快、死亡率高的傳染病，臨床以心包積液為主要病變特征[3]。經(jīng)鑒定，最終確定病原為Ⅰ群禽腺病毒。目前，血清分型表明山東地區(qū)流行的禽腺病毒主要是血清4型和8 a/b型，該病毒造成雞群的死亡率較高，經(jīng)濟損失較大[4-5]。

本研究根據(jù)GenBank中的FAV血清4型的基因組序列，在保守區(qū)域設計了特異性擴增引物和探針，建立了FAV的實時熒光PCR檢測方法，可用于4型FAV樣品的實驗室檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

4型FAV分離毒株GF16和WF816由山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所分離鑒定。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

參照GenBank中FAV的基因組序列，設計引物FAV-FQ-F、FAV-FQ-R、探針P的5’-3序列分別為CTAGGGTTCTGAACTTTG、CGGTAAACATTTCA AGGA和TGACGCCAGTTTCGCTTTCG，探針用FAM和Eclipse熒光染料標記物進行標記。引物及探針均由TaKaRa(大連)公司合成，級別均為HPLC級。

1.2.2 實時熒光PCR

選取雞FAV分離毒株GF16和WF816進行檢測，設血清8型和水作為對照。病毒DNA的提取按照TaKaRa DNAiso試劑操作進行，最后用30 μL超純水來溶解DNA。

Real-time PCR實時熒光PCR采用Probe qPCR進行，反應體系如下：Probe qPCR 緩沖液12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，探針1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL，共25 μL。反應體系為：95 ℃ 30 s，隨后95 ℃ 5 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 20 s進行40個循環(huán)，反應結束后觀察熒光曲線。同時取5 μL反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢驗。以100 bp DNA Ladder的標記物作為參考，TAE緩沖液為電泳緩沖液，電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。

1.2.3 臨床應用

對42份疑似禽腺病毒感染樣品進行上述方法檢測，后續(xù)進行病毒分離、序列測定等來驗證建立的實時熒光PCR的準確性。

2 結果與分析

2.1 實時熒光PCR擴增

禽腺病毒4型的GF16分離毒株和WF816分離毒株實時熒光PCR擴增曲線良好(圖1)，2份樣品的2個平行樣品的Ct值基本一致，為19.3和19.8；陰性對照組未出現(xiàn)擴增曲線。瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增得到預期大小的擴增片段，約150 bp，陰性對照組在此處未出現(xiàn)擴增條帶(圖2)。

圖1 禽腺病毒4型樣品的擴增曲線

M為100 bp DNA Laddar Marker；1為樣品的PCR擴增條帶；2為陰性對照圖2 部分樣品的電泳結果

2.2 敏感性

將模板DNA進行10倍的倍比稀釋，隨后同樣進行實時熒光PCR進行敏感度的檢測。結果表明，本技術的檢測最小量可為100拷貝·μL-1。本方法設計合成的雙標記熒光探針和引物，擴增曲線良好；電泳結果顯示目的條帶清晰，說明探針引物性能良好。

2.3 臨床應用

對42份疑似禽腺病毒感染樣品進行檢測后證實，檢測到14份陽性樣品。經(jīng)后續(xù)的病毒分離、序列測定等證實建立的實時熒光PCR檢測法特異性高，該方法可快速靈敏準確地檢測禽腺病毒4型，極大地縮短檢測時間，同時避免了普通PCR檢測出現(xiàn)的的假陰/陽性情況。因此，本研究所建立的探針實時熒光PCR檢測技術具有快速、準確、靈敏、重復性好等優(yōu)點，可用于FAV樣品的實驗室檢測。

3 討論

本研究建立了可用于檢測禽腺病毒4型的特異性方法。本方法特異性強，與其他幾種家禽主要疫病病毒(8 a/b型FAV、NDV、H9亞型AIV、IBDV)均無交叉反應，所以建立的實時熒光PCR技術可用于臨床檢測。

我國主要流行6個血清型的禽腺病毒(火雞1型、禽1型、4型、5型、8 a/b型)，感染雞群的發(fā)病快、死亡率較高[6-7]。禽腺病毒多存在于禽類的呼吸道和消化道，多數(shù)呈隱性帶毒，但是一旦機體抵抗力下降就會引起發(fā)病，而且往往與其他病毒混合感染，導致死亡率提高[8]。鑒于禽腺病毒的發(fā)病特征和近幾年來我國的高傳播性分布特征，加強本病的快速診斷尤為重要。

參考文獻：

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