地稔預(yù)處理對(duì)大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

許榮成，王濟(jì)緯，蘭 俊，陳 科

藥物預(yù)處理是近年來提出的一個(gè)比較新的概念，在心肌缺血再灌注損傷的治療中應(yīng)用較多，旨在通過藥物提前干預(yù)以促使機(jī)體釋放相關(guān)的生物活性物質(zhì)，增強(qiáng)心臟對(duì)缺血缺氧的耐受，達(dá)到保護(hù)作用[1]。有學(xué)者提出中藥黃芪、姜黃素、芍藥苷等預(yù)處理有改善心肌缺血再灌注損傷的作用[2-3]。地稔為野牡丹科地被植物，可以通過降低脂質(zhì)過氧化，提高機(jī)體清除氧自由基能力來減輕CCl4所致的小鼠肝損傷[4]。但對(duì)肢體缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury of limb，IRIL）是否具有改善仍鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究其對(duì)大鼠IRIL的保護(hù)作用，探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 8周齡成年健康SD大鼠，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，體重200～250 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SYXK（浙）2010-0150。

1.1.2 主要藥物與試劑 地稔全草，由麗水市畬族醫(yī)藥研究所提供。原藥材1000 g經(jīng)煎煮、濾過后濃縮至1 g生藥/mL的地稔全草濃縮液，置于冰箱冷藏。實(shí)驗(yàn)用地稔水煎液由濃縮液+純水稀釋配制而成，濃度0.2 g/mL。試劑：細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1，批號(hào)238960234）、白細(xì)胞介素6（IL-6，批號(hào)230660752）和腫瘤壞死因子α（TNF-α，批號(hào)238260734），試劑盒均購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 南京SOPTOP舜宇顯微鏡ST60；上海手術(shù)器械廠800型離心機(jī)；ACLTOP300CTS全自動(dòng)血凝分析儀；Mutuskan MK3酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 30只SD大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（CG）、模型組（IR）、治療組（MD），每組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，治療組于術(shù)前5 d開始灌胃給藥，劑量為10 mL/kg/次，1次/d，連續(xù)5 d。對(duì)照組與模型組予等量0.9%氯化鈉注射液（10 mL/kg/次）灌胃。

1.2.2 模型制備 術(shù)前12 h禁食，自由飲水。采用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。仰臥位，四肢外展固定。于右腹股溝處備皮、消毒，剪開皮膚。在手術(shù)顯微鏡下分離顯露出右側(cè)股動(dòng)脈，予無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉。顯微鏡下確認(rèn)阻斷動(dòng)脈血流，縫合切口。操作過程中注意保護(hù)股靜脈及股神經(jīng)。同時(shí)予以右大腿根部橡皮帶環(huán)扎，阻斷側(cè)支循環(huán)。通過觀察大鼠右后肢趾端皮膚顏色及皮溫，并與左側(cè)對(duì)比。動(dòng)脈阻斷成功，可見趾端皮膚青紫，發(fā)涼。缺血4 h后松解橡皮帶，取出動(dòng)脈夾，并再次在顯微鏡下檢查血管通暢程度，以確認(rèn)恢復(fù)右下肢血流再灌注。其中，對(duì)照組麻醉后僅做股動(dòng)脈的分離，不夾閉，不捆扎。各組再灌注4 h后，取血進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。

1.2.3 凝血功能檢測 再灌注4 h后，麻醉狀態(tài)下，大鼠心尖取血1.8 mL入含有3.8%構(gòu)椽酸鈉真空采血管中，采用ACLTOP300CTS全自動(dòng)血凝分析儀檢測凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、纖維蛋白原（Fib）及血漿凝血酶時(shí)間（TT）。

1.2.4 血清指標(biāo)檢測 再次心尖取血4 mL入促凝管，靜置30 min待血清析出，放入離心機(jī)經(jīng)3000 r/min離心10 min，取上清液。ELISA法檢測ICAM-1、IL-6和TNF-α含量。具體操作步驟嚴(yán)格按照各試劑盒說明書。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料先采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)判斷數(shù)據(jù)是否為正態(tài)分布，所有數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布且方差齊性，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 地稔預(yù)處理對(duì)各組大鼠凝血功能的影響 與CG組相比，IR組PT、TT和APTT顯著縮短（P＜0.05），F(xiàn)ib含量增加（P＜0.05）；與IR組比較，MD組TT和APTT明顯延長（P＜0.05），PT顯著延長（P＜0.01），F(xiàn)ib含量顯著減少（P＜0.01）。詳見表 1。總的組間P值：PT（P=0.002）；TT（P=0.029）；APTT（P=0.042）；Fib（P=0.013）。

表1 各組大鼠凝血功能比較（，n=10）

表1 各組大鼠凝血功能比較（，n=10）

注：與CG組比較，aP＜0.05；與IR組比較，bP＜0.05 bbP＜0.01

組別 PT(s) APTT(s) TT(s) Fib(g/L)CG 組 9.84±0.69 24.06±5.02 22.38±3.99 1.78±0.23 IR 組 8.99±0.64a 19.55±3.74a 18.84±3.11a 2.05±0.24a MD 組 10.03±0.56bb 23.97±4.56b 22.45±3.23b 1.76±0.21bb

2.2 地稔對(duì)大鼠血清炎癥因子ICAM-1、IL-6及TNF-α的影響 與CG組相比，IR組血清中炎癥指標(biāo)ICAM-1、IL-6及TNF-α表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05）；MD 組 ICAM-1、IL-6 及 TNF-α含量則顯著降低，與IR組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。總的組間P值：ICAM-1（P=0.001）；IL-6（P=0.001）；TNF-α（P=0.003）。

表2 各組大鼠血清炎癥因子ICAM-1、IL-6及TNF-α的含量比較（，n=10，pg/mL）

表2 各組大鼠血清炎癥因子ICAM-1、IL-6及TNF-α的含量比較（，n=10，pg/mL）

注：與CG組比較，aP＜0.05；與IR組比較，bP＜0.05 bbP＜0.01

組別 ICAM-1 IL-6 TNF-α CG 組 608.25±47.90 73.19±6.09 28.20±3.17 IR 組 728.41±96.68a 89.04±7.31a 38.85±3.15a MD 組 603.05±44.09bb 76.50±6.92bb 30.85±4.33bb

3 討論

IRIL多見于擠壓傷、術(shù)中止血帶的使用、斷肢再植等，與氧自由基的釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、白細(xì)胞的遷移等有關(guān)[5]，具有極其復(fù)雜的病理生理過程。有研究發(fā)現(xiàn)，IRIL過程中產(chǎn)生的血小板活化因子不僅可直接作用于血管壁，使血管通透性增加，還可誘導(dǎo)血小板聚集[6]。缺血預(yù)處理由Murry等于1986年首次提出，即短暫而反復(fù)的缺血和再灌注不會(huì)造成損傷的疊加，反而可以提高心肌組織對(duì)缺血缺氧的耐受性[7]。由于倫理學(xué)原因，這一理論在臨床應(yīng)用受到了一定的限制，于是又有學(xué)者提出了藥物預(yù)處理[8]。已被證實(shí)有此作用的藥物有去甲腎上腺素、七氟醚等，另外，常用的預(yù)處理藥物如黃芪[9]、丹參[10]、芍藥苷[11]等，均對(duì)缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。地稔作為畬族常用藥材，具有祛瘀利濕、清熱解毒之功效。其化學(xué)成分主要有多糖、黃酮類、酚類等[12]。有學(xué)者提出，地稔水煎液還有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎[13]、止血凝血作用[14-15]。本研究采用術(shù)前5 d地稔全草水煎液預(yù)處理的方式，觀察地稔對(duì)IRIL大鼠的凝血功能及相關(guān)炎癥因子的影響。

嚴(yán)重的IRIL會(huì)引起全身炎性反應(yīng)綜合征[16]，造成機(jī)體代謝及凝血功能的障礙，伴發(fā)器官功能障礙或衰竭，嚴(yán)重者可致死。IRIL對(duì)機(jī)體凝血和纖溶系統(tǒng)均有顯著的影響，在引起血液高凝的同時(shí)又抑制了纖溶活性[17]。主要體現(xiàn)在體內(nèi)纖溶酶原激活劑表達(dá)下降，TT和APTT的縮短。本研究結(jié)果顯示，肢體缺血再灌注后，PT、TT和APTT顯著縮短，F(xiàn)ib含量上升（P＜0.05），提示機(jī)體處于高凝狀態(tài)，纖溶受抑。與IR組比較，地稔的提前干預(yù)，則改變了這種狀態(tài)，使得TT和APTT延長（P＜0.05），PT顯著延長（P＜0.01），F(xiàn)ib明顯減少（P＜0.01）。APTT和PT主要反映內(nèi)、外源性凝血系統(tǒng)狀況，F(xiàn)IB反映了纖維蛋白原含量。本研究提示，地稔預(yù)處理對(duì)IRIL大鼠的內(nèi)、外源性凝血系統(tǒng)都有作用，且能改善纖溶系統(tǒng)活性。

ICAM-1是一種單鏈糖蛋白，屬黏附分子免疫球蛋白超家族類。廣泛分布于體內(nèi)多種細(xì)胞，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、各種上皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等。近年來的諸多研究都表明，ICAM-1在缺血再灌注損傷中起著十分重要的作用[18]。其主要功能是介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附[19]，促使白細(xì)胞浸潤與聚集于缺血組織，阻塞血管，導(dǎo)致血管收縮，減少血流量，同時(shí)釋放出自由基等毒性物質(zhì)，進(jìn)一步加重缺血細(xì)胞的損傷。TNF-α和IL-6作為體內(nèi)重要的炎癥因子，對(duì)機(jī)體的許多炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)都有調(diào)節(jié)和介導(dǎo)作用。其中IL-6是單核巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞在TNF-α的刺激下分泌的，是急性炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，其主要作用為對(duì)多種細(xì)胞的促炎作用和對(duì)肝組織的誘導(dǎo)，促使合成多種急性時(shí)相蛋白[20]。IL-6的增多可刺激中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中ICAM-1的表達(dá),誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞功能上調(diào)，造成缺血組織的損傷[21]。正常情況下體內(nèi)TNF-α濃度較低，具有抗感染、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等多種生理功能，具有一定的保護(hù)作用。而TNF-α濃度升高后，就成為了重要的炎癥遞質(zhì)，誘導(dǎo) IL-6、IL-8的表達(dá)，在許多炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用，造成器官及系統(tǒng)受損[22]。

在本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠血清中ICAM-1、TNF-α和IL-6含量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這就進(jìn)一步證實(shí)，在缺血再灌注對(duì)機(jī)體造成損傷時(shí)，上述炎癥因子發(fā)揮了重要作用。而經(jīng)過地稔預(yù)處理后的大鼠在面臨IRIL時(shí)，體內(nèi)的炎癥反應(yīng)就相對(duì)減輕許多，從而機(jī)體的損害也會(huì)較少，體現(xiàn)在ICAM-1、TNF-α和IL-6表達(dá)的下降，并且與IR組比，存在顯著差異（P＜0.01）。因此，地稔水煎液的預(yù)處理在改善肢體缺血再灌注損傷大鼠血液高凝狀態(tài)及影響纖溶活性方面有一定作用，同時(shí)可以減輕大鼠的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與降低ICAM-1、TNF-α和IL-6的表達(dá)有關(guān)。

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