Claudin 3在肺鱗癌和腺癌的表達(dá)差異及預(yù)后探討

車娟娟，王 婧，李卉惠，趙 磊，甄洪超，曹邦偉

肺癌是目前全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均極高的惡性腫瘤之一，5年生存率徘徊在15%左右[1]。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)（ACS）的最新數(shù)據(jù)顯示：2018年美國(guó)預(yù)計(jì)有234,030例新發(fā)肺癌病例，預(yù)計(jì)將有154,050例患者死于肺癌，占所有癌癥死亡總數(shù)的26%[2]。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）主要由肺鱗癌和腺癌構(gòu)成，近年來腺癌比例逐漸增高。短期出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移依舊是影響術(shù)后肺鱗癌和腺癌生存的主要因素。Claudins蛋白家族是細(xì)胞緊密連接的主要成分，其異常表達(dá)是腫瘤發(fā)展過程中的關(guān)鍵步驟，并且與多種腫瘤的預(yù)后相關(guān)[3-5]。本研究通過回顧性分析我院2010年1月—2014年12月行手術(shù)切除的肺鱗癌和腺癌患者各80例，免疫組化檢測(cè)Claudin3的表達(dá)狀況，探討其在肺鱗癌與腺癌中的表達(dá)差異，并進(jìn)一步分析其與臨床病理因素和預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例收集：收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院2010年1月—2014年12月手術(shù)切除的肺鱗癌和腺癌石蠟包埋標(biāo)本各80例，共計(jì)160例，請(qǐng)高年資的病理醫(yī)師復(fù)習(xí)病理切片。

病例入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前接受胸部CT掃描、腦CT或MR掃描、腹部B超或CT，排除腦、肝、腎上腺、對(duì)側(cè)肺內(nèi)無轉(zhuǎn)移，全身ECT骨掃描檢查（部分患者行PET-CT檢查）排除骨轉(zhuǎn)移的患者；（2）術(shù)前未接受任何放、化療等抗癌治療；（3）依據(jù)NCCN指南要求，行肺癌根治性切除術(shù)及隨訪資料完整患者為研究對(duì)象，排除術(shù)后1月內(nèi)死亡病例。

治療方式：所有患者均經(jīng)手術(shù)治療，其中I～Ⅲa期患者給予手術(shù)為主的綜合治療，Ⅱ-Ⅲa期患者術(shù)后予以輔助化療，部分IIIa期患者行輔助放療。其中化療采用NSCLC的常規(guī)方案，包括長(zhǎng)春瑞濱聯(lián)合順鉑或卡鉑（NP）、培美曲塞聯(lián)合順鉑或卡鉑（PP）、紫杉醇聯(lián)合順鉑或卡鉑（TP）、吉西他濱聯(lián)合順鉑或卡鉑（GP）等；放療包括對(duì)病灶、縱隔及雙側(cè)鎖骨上的淋巴結(jié)的放射治療。

表1 肺鱗癌及腺癌患者的臨床資料情況

1.2 免疫組化檢測(cè)方法 采用免疫組化SP法對(duì)所有標(biāo)本中的Claudin 3蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，具體方法：4 μm厚的組織切片常規(guī)脫蠟、梯度乙醇入水。應(yīng)用3%的H2O2避光室溫放置20 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，使用0.1%枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）高溫高壓修復(fù)抗原后，滴加10%正常山羊血清反應(yīng)20 min，加Claudin 3一抗（1:100稀釋，Assay Biotech，Sunnyvale，CA，USA），4 ℃過夜后，加入生物素標(biāo)記的二抗，在37 ℃孵育30 min，二甲基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。封固后在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。以宮頸癌組織染色結(jié)果作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

免疫組化著色結(jié)果判斷Claudin 3陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜。免疫組化反應(yīng)根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比分級(jí)為0～3級(jí)。0分：沒有著色或者陽性細(xì)胞小于10%；1分：大于10%的腫瘤細(xì)胞淺著色或者10%～40%的細(xì)胞中等著色；2分：大于40%的腫瘤細(xì)胞中等著色或者10%～40%的腫瘤細(xì)胞強(qiáng)著色；3分：大于40%的細(xì)胞強(qiáng)著色。為了便于統(tǒng)計(jì)分析，將0～1分者定義為陰性組，將2～3分者定義為陽性組。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法及隨訪 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，率的檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析，多因素分析利用Cox回歸模型進(jìn)行，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生存時(shí)間定義為：自手術(shù)治療之日至末次隨訪日或死亡的時(shí)間，以年為單位計(jì)算。失訪或隨訪截止時(shí)仍存活者視為截尾數(shù)據(jù)，隨訪終止日期為2017年1月1日。

2 結(jié)果

2.1 Claudin 3在NSCLC中的表達(dá)情況及與臨床病理因素的關(guān)系 免疫組化法檢測(cè)Claudin 3表達(dá)如圖1，Claudin 3陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜上。分析160例患者中，Claudin 3表達(dá)情況與臨床病理因素關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Claudin 3表達(dá)與性別、年齡、吸煙史、TNM分期及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性，而僅僅與病理類型相關(guān)，結(jié)果如表2所示。2.2 患者生存的預(yù)后因素分析 應(yīng)用Kaplan-Meier法對(duì)160例肺鱗癌和腺癌患者相關(guān)因素進(jìn)行單因素分析顯示：性別、年齡、吸煙史、病理類型、術(shù)后輔助化療及Claudin 3表達(dá)等因素對(duì)患者生存率的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而T分期、N分期、TNM分期及是否復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等因素對(duì)患者生存率的影響有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

圖1 免疫組化檢測(cè)Claudin 3在NSCLC組織表達(dá)情況

表2 160肺癌標(biāo)本中Claudin 3陽性表達(dá)與臨床因素的關(guān)系

對(duì)上述進(jìn)行單因素分析的因素進(jìn)一步納入Cox回歸模型，行多因素分析顯示：TNM分期（P=0.000）和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移（P=0.000）是NSCLC獨(dú)立的預(yù)后影響因素，其生存曲線分別如圖2、圖3所示。

2.3 Claudin 3表達(dá)狀況在不同病理亞型分層分析結(jié)果 鑒于不同病理亞型中Claudin 3的表達(dá)差異，為了進(jìn)一步明確Claudin 3在不同肺癌亞型的臨床意義，我們進(jìn)一步進(jìn)行分層分析，結(jié)果如下表4所示。兩個(gè)亞組的生存曲線如圖4、5。

表3 NSCLC患者的預(yù)后因素的單因素分析結(jié)果

圖2 不同TNM分期患者的生存曲線

圖3 是否復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的生存曲線

表4 160例肺癌患者預(yù)后因素的分層分析結(jié)果

圖4 鱗癌患者中不同Claudin3表達(dá)的生存曲線

圖5 腺癌患者中不同Claudin3表達(dá)的生存曲線

3 討論

肺癌是目前全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均極高的惡性腫瘤之一。ACS數(shù)據(jù)顯示：肺癌發(fā)病率的變化存在性別差異，自80年代以來，男性肺癌發(fā)病率一直在下降，2010—2014年，平均每年下降約2.9%；而女性肺癌發(fā)病率的下降滯后于男性，約從2005開始出現(xiàn)下降[6]。并且在臨床實(shí)踐中大約50%的病例是肺腺癌[7]。在我國(guó)，肺癌的發(fā)病率卻逐年升高，并且在許多大城市肺癌的發(fā)病率已占常見惡性腫瘤的首位[8]。NSCLC約占肺癌的85%，肺鱗癌和肺腺癌構(gòu)成NSCLC的主要病理類型，肺腺癌的發(fā)病率逐年升高，且肺腺癌更多見于非吸煙的患者[9]。手術(shù)切除為主的綜合治療可以明顯提高患者生存率。NSCLC預(yù)后受多種因素影響，本研究通過多因素分析顯示TNM分期（P=0.000）和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移（P=0.000）是NSCLC獨(dú)立的預(yù)后影響因素。

Claudins跨膜蛋白家族是構(gòu)成細(xì)胞緊密連接的主要骨架結(jié)構(gòu)，它們可以直接調(diào)控TJ的滲透性。目前發(fā)現(xiàn)Claudins包括27種家族成員，遠(yuǎn)端肺上皮細(xì)胞主要表達(dá)Claudin 3（CLDN3）和Claudin 4[10]，CLDN3在肺的屏障功能中發(fā)揮了重要作用。同時(shí)CLDN3是產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌內(nèi)毒素的天然受體，兩者結(jié)合后能夠?qū)е录?xì)胞快速溶解，而產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌內(nèi)毒素能夠有效地抑制CLDN3表達(dá)的惡性腫瘤[11]，由此CLDN3將可能作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。我們的研究發(fā)現(xiàn)CLDN3在IIIA期肺腺癌中的陽性表達(dá)率明顯高于I期患者，并且CLDN3陽性表達(dá)患者的5年生存率明顯低于陰性患者（34.9% vs 57.2%）。我們的研究結(jié)果與張連明等[12]的研究結(jié)果相一致，他們發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，肺腺癌組織中CLDN3的表達(dá)量顯著升高，并且CLDN3的過表達(dá)與肺腺癌細(xì)胞的惡性潛能及ERK1/2和PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)。與肺腺癌相反，我們發(fā)現(xiàn)CLDN3在IIIA期肺鱗癌組織中的陽性表達(dá)率明顯低于I期患者，CLDN3陽性表達(dá)患者的5年生存率明顯優(yōu)于陰性患者（57.4% vs 29.9%），這與我們之前的研究結(jié)果相一致[13]。并且我們之前的研究發(fā)現(xiàn)CLDN3可以通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而抑制肺鱗癌侵襲和轉(zhuǎn)移[13-14]。進(jìn)一步對(duì)CLDN3進(jìn)行分層并行生存分析顯示CLDN3分別是肺鱗癌和肺腺癌的獨(dú)立預(yù)后影響因素[14]。Judit等[15]也發(fā)現(xiàn)與正常肺組織相比，CLDN 3在肺腺癌中表達(dá)增加，而在肺鱗癌中表達(dá)下降。分析CLDN3在肺鱗癌和肺腺癌中表達(dá)差異的原因，我們推測(cè)與肺鱗癌和肺腺癌來源及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程不同相關(guān)，肺鱗癌起源于段和亞段支氣管黏膜上皮，經(jīng)鱗狀上皮化生、異型增生和原位癌等階段再演進(jìn)為肺鱗癌。而肺腺癌來自支氣管的黏膜上皮和腺上皮，大多起源于較小的支氣管黏膜分泌黏液的上皮細(xì)胞。此外，放射誘導(dǎo)的小鼠肺腺癌模型發(fā)現(xiàn)肺腺癌主要來源于II型肺泡上皮細(xì)胞，腺鱗癌和鱗癌來源于其它肺上皮細(xì)胞，而CLDN3主要是由II型肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)[16]。因此CLDN3在肺腺癌中的高表達(dá)可能是相對(duì)的，而不是絕對(duì)的，Lin等[17]也認(rèn)為在卵巢癌的形成過程中經(jīng)歷了間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化過程，而卵巢癌組織中CLDN3和Claudin4的高表達(dá)是相對(duì)的，而不是絕對(duì)的。目前所有文獻(xiàn)報(bào)道中，尚未見到比較CLDN3不同表達(dá)程度對(duì)預(yù)后的影響，后續(xù)的研究中，我們會(huì)擴(kuò)大病例數(shù)進(jìn)一步研究探索。

T分期及N分期成為NSCLC預(yù)后的獨(dú)立影響因素。依據(jù)國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)（IASLC）最新數(shù)據(jù)庫分析，IASLC對(duì)第七版腫瘤、淋巴結(jié)和轉(zhuǎn)移（TNM）分期系統(tǒng)進(jìn)行了修訂。N分期方面維持不動(dòng)，T 分期方面變動(dòng)最大的是，腫瘤大小是一個(gè)重要的預(yù)后因素，具體為：距隆突小于2 cm的支氣管及全部的肺不張/肺炎均歸為T2，膈肌浸潤(rùn)歸為T4，因?yàn)榕cT3相比，膈肌浸潤(rùn)的預(yù)后與T4更相似，縱隔胸腔浸潤(rùn)由于很少使用而不再用于描述T分期。我們依據(jù)15最新的TNM分期，T1、T2、T3及T4期5年生存率分別為57.6%、48.0%、22.8%和19.9%，發(fā)現(xiàn)隨著T分期的增加，生存率逐漸下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000）。此外，更新的推薦將IA期患者進(jìn)行了細(xì)分；設(shè)立了ⅢC期，即T3和T4期且N3的患者，將Ⅳ期患者分為ⅣA期（胸腔內(nèi)轉(zhuǎn)移）和ⅣB期（單一/多發(fā)胸腔外轉(zhuǎn)移）。我們的研究顯示，I期、II期及IIIA期5年生存率分別為61.6%、46.3%和18.2%，發(fā)現(xiàn)隨著TNM分期的增加，生存率逐漸下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000）。這提示我們新TNM分期能夠合理精確地指導(dǎo)術(shù)后恰當(dāng)?shù)木C合治療，結(jié)合我們的資料，新分期可以更加準(zhǔn)確的反應(yīng)預(yù)后。

[1] Moore W, Talati R, Bhattacharji P, et al. Five-year survival after cryoablation of stage I non-small cell lung cancer in medically inoperable patients[J]. J Vasc Interv Radiol,2015,26(3):312-319.

[2] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2018[J]. CA Cancer J Clin,2018,68(1):7-30.

[3] Romanov V, Whyard TC, Waltzer WC, et al. A CLDN3 and claudin 4-targeted Clostridium perfringens protoxin is selectively cytotoxic to PSA-producingprostate cancer cells[J]. Cancer Lett,2014, 351(2): 260-264.

[4] Che J, Yang Y, Xiao J, et al. Decreased expression of claudin-3 is associated with a poor prognosis and EMT in completely resected squamous cell lung carcinoma[J]. Tumour Biol, 2015, 36(8):6559-6568.

[5] Todd MC, Petty HM, King JM, et al. Overexpression and delocalization of claudin-3 protein in MCF-7 and MDA-MB-415 breast cancer cell lines[J]. Oncol Lett, 2015, 10(1): 156-162.

[6] Smith RA, Andrews KS, Brooks D, et al. Cancer screening in the United States, 2018: A review of current American Cancer Society guidelines and current issues in cancer screening[J]. CA Cancer J Clin, 2018,doi: 10.3322/caac.21446. [Epub ahead of print]

[7] Noone AM, Cronin KA, Altekruse SF, et al. Cancer incidence and survival trends by subtype using data from the Surveillance Epidemiology and End Results Program, 1992-2013[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2017, 26(4): 632-641.

[8] 陳萬青, 鄭榮壽, 張思維, 等. 2013年中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J]. 中國(guó)腫瘤, 2017, 25(1): 1-8.

[9] Novello S, Barlesi F, Califano R, et al. Metastatic non-small-cell lung cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis,treatment and follow-up[J]. Ann Oncol, 2016, 27(suppl 5): v1-v27.

[10] Günzel D. Claudins: vital partners in transcellular and paracellular transport coupling[J]. Pf l ugers Arch, 2017, 469(1): 35-44.

[11] Romani C, Cocco E, Bignotti E, et al. Evaluation of a novel human IgG1 anti-CLDN3 antibody that specifically recognizes its aberrantly localized antigen in ovarian cancer cells and that is suitable for selective drug delivery[J]. Oncotarget, 2015, 6(33):34617-34628.

[12] Zhang L, Wang Y, Zhang B, et al. Claudin-3 expression increases the malignant potential of lung adenocarcinoma cells: role of epidermal growth factor receptor activation[J]. Oncotarget, 2017,8(14): 23033-23047.

[13] Che J, Yue D, Zhang B, et al. Claudin-3 Inhibits Lung Squamous Cell Carcinoma Cell Epithelial-mesenchymal Transition and Invasion via Suppression of the Wnt/β-catenin Signaling Pathway[J]. Int J Med Sci, 2018, 15(4): 339-351.

[14] Che JJ, Yang YF, Xiao J, et al. Decreased expression of claudin-3 is associated with a poor prognosis and EMT in completely resected squamous cell lung carcinoma[J]. Tumour Biol, 2015,36(8): 6559-6568.

[15] Judit Moldvay, Márta J?ckel, Csilla Páska, et al. Distinct claudin expression profile in histologic subtypes of lung cancer[J]. Lung Cancer, 2007, 57(2): 159-167.

[16] Oghiso Y, Yamada Y. Immunohistochemical study on cellular origins of rat lung tumors induced by inhalation exposures to plutonium dioxide aerosols as compared to those by X-ray irradiation[J]. J Radiat Res, 2002, 43(3): 301-311.

[17] Lin X, Shang X, Manorek G, et al. Regulation of the Epithelial-Mesenchymal Transition by Claudin-3 and Claudin-4[J]. PLoS One, 2013, 8(6): e67496.