菠菜霜霉病抗性遺傳與育種研究進(jìn)展

蔡曉鋒，王小麗，徐晨曦，葛晨輝，王水，王全華

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，植物種質(zhì)資源工程技術(shù)研究中心，植物種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，200234）

菠菜（Spinacia oleraceaL.）屬于莧科藜亞科菠菜屬植物[1]，是世界上一種重要的經(jīng)濟(jì)蔬菜作物，是以綠葉為主要產(chǎn)品器官的一、二年生草本植物。菠菜起源于波斯地區(qū)（今伊朗及周邊），于公元647年傳入中國(guó)，被稱為波斯菜。由于其生長(zhǎng)迅速并且耐低溫，可以越冬栽培，在世界上許多國(guó)家均有種植。根據(jù)聯(lián)合國(guó)世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2016年世界上菠菜產(chǎn)量約為2 668.4萬(wàn)t（59個(gè)菠菜生產(chǎn)國(guó)數(shù)據(jù)），其中菠菜的生產(chǎn)主要集中在中國(guó)，約為2 448.5萬(wàn)t，占世界總產(chǎn)量的91.8%；并且菠菜產(chǎn)量在中國(guó)蔬菜產(chǎn)量排名中位于第7位，占中國(guó)蔬菜總產(chǎn)量的4.21%，中國(guó)是世界上最大的菠菜種植國(guó)家及消費(fèi)國(guó)家（http://www.fao.org/faostat/en/#data）。

菠菜是一種重要的深綠色葉用蔬菜，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并逐漸被列入健康飲食菜單[2]。菠菜葉片含有豐富的β-胡蘿卜素、葉酸、葉黃素、維生素B、維生素K、維生素E和維生素C；同時(shí)富含鈣、磷、鈉和鉀等礦物質(zhì)元素；另外新鮮葉片中還含有豐富的抗氧化劑，是氧自由基吸收能力活性最高的蔬菜之一[3，4]。近幾年來(lái)，隨著生活水平的提高，人們對(duì)菠菜產(chǎn)品的消費(fèi)量越來(lái)越大，同時(shí)對(duì)菠菜產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)和品質(zhì)也提出了更高的要求，另外在長(zhǎng)期、大面積的生產(chǎn)過(guò)程中，菠菜病害也隨之發(fā)展，為害加重，尤其是霜霉病的大面積暴發(fā)，給種植者造成重大的損失，無(wú)法滿足市場(chǎng)供應(yīng)，因此選育營(yíng)養(yǎng)豐富、抗病的優(yōu)良新品種是解決此問(wèn)題的關(guān)鍵。而收集種質(zhì)資源、篩選鑒定菠菜抗病相關(guān)基因是進(jìn)行菠菜抗病育種的前提和基礎(chǔ)。本文從菠菜種質(zhì)資源的收集、抗性遺傳與育種、分子標(biāo)記及抗性機(jī)理等方面，綜述了菠菜抗病遺傳育種的研究進(jìn)展，以期為菠菜抗病育種提供參考。

1 菠菜霜霉病及抗性種質(zhì)資源

菠菜生產(chǎn)中的主要病害是霜霉病和白銹病等，尤其以霜霉病最為嚴(yán)重。菠菜霜霉病是由專性病原體（Peronospora farinosaf.sp.spinaciae，Pfs）引起的氣傳病害[5]，主要為害植株葉片，苗期和成株期均可發(fā)生，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是菠菜上的毀滅性病害。

菠菜栽培歷史悠久、地域分布廣、種質(zhì)資源豐富，具有1個(gè)栽培種和2個(gè)野生型（S.turkestanica和S.tetrandra），國(guó)內(nèi)外的科研機(jī)構(gòu)對(duì)菠菜種質(zhì)資源進(jìn)行了廣泛收集。據(jù)荷蘭遺傳資源中心Kik博士[6]報(bào)道，荷蘭遺傳種質(zhì)資源中心（CGN）保存菠菜種質(zhì)資源（包括野生種）387份，中國(guó)國(guó)家作物種質(zhì)庫(kù)保存菠菜種質(zhì)資源326份，美國(guó)農(nóng)業(yè)部（USDA）保存菠菜種質(zhì)資源301份，其他國(guó)家的科研機(jī)構(gòu)也保存著大量的菠菜種質(zhì)資源，共計(jì)1 938份。自20世紀(jì)50年代始，我國(guó)的蔬菜科研單位就開(kāi)始了菠菜種質(zhì)資源的收集鑒定工作，目前已從我國(guó)27個(gè)省、市和其他3個(gè)國(guó)家共搜集入國(guó)家作物種質(zhì)庫(kù)保存的菠菜種質(zhì)資源333份[7]，豐富的菠菜種質(zhì)資源為后期進(jìn)行菠菜抗病育種提供基礎(chǔ)。

2 菠菜霜霉病抗性遺傳及育種

盡管菠菜霜霉病抗性遺傳規(guī)律和抗性機(jī)制仍不明確，然而育種家們通過(guò)田間抗性鑒定，篩選抗性材料，培育出一系列的抗病品種。菠菜霜霉病菌首次報(bào)道是在1800年，但在1991年之前才鑒定出4個(gè)菠菜霜霉病菌生理小種[8]。在發(fā)現(xiàn)菠菜霜霉病生理小種3之前，一直認(rèn)為菠菜霜霉病對(duì)生理小種1、2的抗性受1個(gè)顯性基因控制，而在發(fā)現(xiàn)該生理小種3后，發(fā)現(xiàn)菠菜霜霉病抗性基因受到2個(gè)連鎖的基因控制。國(guó)外的育種家針對(duì)這些生理小種篩選抗病資源，培育出抗病一代雜種，如Califlay、Dixie Market、Mazurka、Polka、Bolero 和 Bossanova 等[2]；而在接下來(lái)的20 a間則鑒定出10個(gè)霜霉病菌生理小種，并且發(fā)現(xiàn)部分新的生理小種對(duì)所有已知的遺傳抗性免疫[9，10]，育種家們針對(duì)這些新的生理小種尋找新的抗原，并培育出新的抗病品種，如El Dorado、El Palmar、Emilia、Lazio 和 Lombardia 等可以抗 1～10號(hào)生理小種。到目前為止，已經(jīng)分離鑒定出16個(gè)菠菜霜霉病生理小種[2，11，12]，為針對(duì)不同地區(qū)不同生理小種進(jìn)行有目的的抗病育種工作奠定了基礎(chǔ)。

表1 菠菜霜霉病抗性位點(diǎn)、所抗生理小種及連鎖的遺傳標(biāo)記

我國(guó)對(duì)菠菜霜霉病的研究則相對(duì)滯后，只有少量研究報(bào)道對(duì)我國(guó)存在的菠菜霜霉病菌生理小種進(jìn)行分離鑒定，僅有范桂彥等[13]對(duì)5份采集于北京、山東、山西的霜霉病樣品進(jìn)行菠菜霜霉病菌生理小種鑒定，尚未見(jiàn)其他關(guān)于菠菜霜霉病菌生理小種鑒定的報(bào)道[13]。目前仍主要通過(guò)田間鑒定法進(jìn)行抗霜霉病菠菜品種選育如滬菠1號(hào)的選育[14]，和不同品種的比較試驗(yàn)[15]等。在一些抗白銹病品種的推廣過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)有些品種對(duì)霜霉病也表現(xiàn)田間抗性，但是具體的抗性遺傳機(jī)制還不清楚[2]。

我國(guó)菠菜生產(chǎn)中使用的抗霜霉病品種主要來(lái)自國(guó)外種子公司。這些國(guó)外抗病品種的大量推廣和單一使用，進(jìn)一步造成霜霉病菌的擴(kuò)散和快速進(jìn)化，致使我國(guó)菠菜霜霉病菌生理小種急劇增加，常導(dǎo)致已經(jīng)大量推廣應(yīng)用的抗病品種不再抗病[16]。因此，培育抗病能力更強(qiáng)、適應(yīng)范圍更廣的菠菜新品種已成為目前抗病育種工作中急待解決的問(wèn)題。

3 菠菜抗霜霉病分子標(biāo)記及抗性機(jī)理研究

菠菜霜霉病抗性的鑒定主要是通過(guò)檢測(cè)病原菌的致病性，但是該方法耗時(shí)、耗力并且需要特定的環(huán)境條件進(jìn)行病原菌的接種、篩選和鑒定，該過(guò)程控制不當(dāng)極易引起霜霉病病原菌擴(kuò)散。因此，篩選開(kāi)發(fā)與霜霉病抗性位點(diǎn)或基因連鎖的分子標(biāo)記，是更有效、更便捷的選育抗霜霉病新品種的方式。

Irish等[17]通過(guò)4次輪回回交，以抗病材料Lion和感病材料Viroflay為親本構(gòu)建菠菜霜霉病抗性（生理小種6）近等基因系（NIL1）。根據(jù)分離群體分析發(fā)現(xiàn)，該菠菜霜霉病抗性是由一個(gè)顯性基因控制，并將此抗性位點(diǎn)命名為Pfs-1。利用群體分離分析 （Bulk segregant analysis） 鑒 定 一 個(gè) AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）標(biāo)記與Pfs-1位點(diǎn)連鎖，用該連鎖位點(diǎn)開(kāi)發(fā)了一個(gè)共顯性SCAR（Sequence Characterized Amplified Region）標(biāo)記，這個(gè)SCAR標(biāo)記與單顯性基因控制位點(diǎn)Pfs-1緊密連鎖（約1.7 cM），命名為Dm-1（表1）。通過(guò)對(duì)123個(gè)品種檢測(cè)，Dm-1標(biāo)記可以正確區(qū)分120個(gè)品種的抗病表型；此外，包含Pfs-1位點(diǎn)的近等基因系抗多個(gè)霜霉病生理小種，說(shuō)明Pfs-1位點(diǎn)可能包含抗性基因簇[9]。

前期霜霉病抗性鑒定結(jié)果認(rèn)為，霜霉病抗性受6個(gè)位點(diǎn)的控制[9，17]。因?yàn)樗共∩硇》N命名時(shí)經(jīng)常采用Pfs或Pf縮寫(xiě)，而第一個(gè)鑒定的霜霉病抗性位點(diǎn)也被命名為Pfs-1[17]，所以極容易造成混淆。為了便于區(qū)分將6個(gè)菠菜霜霉病抗性位點(diǎn)重新命名為 RPF1 ～RPF6 （Resistance againstPeronospora farinosa），RPF1即前期鑒定的Pfs-1位點(diǎn)，而其2個(gè)等位基因被分別命名為RPF1-1（顯性基因）和RPF1-2（隱性基因）[2]。含有RPF2抗性位點(diǎn)的菠菜可以抗1～10號(hào)生理小種，而11號(hào)生理小種可以克服菠菜品種對(duì)1～10號(hào)生理小種的抗性，但包含RPF1，RPF3和RPF6抗性位點(diǎn)的菠菜可以抗11號(hào)生理小種；生理小種12可以侵染含有RPF1和RPF2的菠菜品種，RPF3位點(diǎn)可以抗12號(hào)生理小種。13號(hào)生理小種可以克服RPF2和RPF3抗性位點(diǎn)對(duì)菠菜的保護(hù)，而包含RPF1位點(diǎn)的菠菜可以高效抵抗13號(hào)生理小種侵染。14號(hào)生理小種與12號(hào)生理小種相似，能夠引起相同的病態(tài)反應(yīng)，可以通過(guò)一些新的感病品種Pigeon、Cello和Celesta對(duì)它們加以區(qū)分[18]。

Feng等[19，20]利用新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)菠菜霜霉病病原菌12、13、14號(hào)生理小種進(jìn)行基因組測(cè)序，鑒定了1 000個(gè)左右簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）和9 000個(gè)SNP位點(diǎn)，并根據(jù)霜霉病病原菌UA0510C的Pfs基因組測(cè)序結(jié)果，篩選出48對(duì)SSR引物，檢測(cè)了6、10、11、12、13、14 號(hào)生理小種；結(jié)果表明，48 對(duì)引物可以擴(kuò)增出Pfs基因片段，其中4對(duì)引物還可以擴(kuò)增其他同類的病原菌基因；另外有32對(duì)引物在Pfs基因擴(kuò)增片段中具有多態(tài)性，并且部分引物鑒定出一些雜合位點(diǎn)，表明該位點(diǎn)屬于雜合抗性。Shi[21]利用 GBS（genotyping by sequencing）技術(shù)對(duì) 462 個(gè)菠菜基因型測(cè)序，獲得475 000 SNPs，通過(guò)關(guān)聯(lián)分析篩選出4個(gè)與菠菜霜霉病緊密連鎖的SNP標(biāo)記。雖然抗霜霉病分子標(biāo)記取得了一些進(jìn)展，為培育抗病品種提供了分子依據(jù)，但相關(guān)抗性基因克隆還未見(jiàn)報(bào)道，菠菜抗霜霉病機(jī)理仍不明確。

4 菠菜抗性相關(guān)基因研究進(jìn)展

盡管菠菜中6個(gè)與霜霉病抗性相關(guān)的位點(diǎn)尚未克隆或鑒定，但在擬南芥中霜霉病抗性機(jī)制的研究報(bào)道也有很多，可為研究菠菜霜霉病抗性機(jī)制提供良好的支持。到目前為止，已鑒定出28個(gè)不同的擬南芥霜霉病抗性基因（Recognition ofPeronospora parasitica，RPP）[22]，并且其中一些基因已被克隆和功能分析，如 RPP1、RPP5 和 RPP13[23～25]。 所有克隆的RPP基因均屬于植物抗性基因（Resistance，R）家族，NBS-LRR類亞家族 （Nucleotide binding siteleucine-rich repeats）。此外，許多RPP基因定位于MRCs（Major recognition gene complexes）基因位點(diǎn)上，如RPP5位點(diǎn)包含7個(gè)TIR-NBS-LRR類R基因，3個(gè)相關(guān)序列和2個(gè)非R基因[26]。而菠菜RPF1位點(diǎn)對(duì)多個(gè)霜霉病生理小種的抗性可能與RPP5位點(diǎn)相似，均含有多個(gè)抗性基因，對(duì)菠菜快速適應(yīng)和抵御多變的病原菌生理小種具有重要意義。

Bai等[27]在菠菜中克隆并鑒定了一個(gè)病程相關(guān)蛋白基因SoPR10；Feng等[28]通過(guò)對(duì)不含抗霜霉病位點(diǎn)、含有1個(gè)和2個(gè)霜霉病位點(diǎn)菠菜品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在菠菜品種Viroflay和Califlay之間發(fā)現(xiàn)上百個(gè)NBS-LRR抗病基因，同時(shí)也鑒定出一些病程相關(guān)蛋白基因如幾丁質(zhì)酶基因（Classes I to IV）。此外還發(fā)現(xiàn)1 800 SSRs，超過(guò) 6 000個(gè)SNPs，為分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。Xu等[29]通過(guò)對(duì)菠菜栽培種進(jìn)行全基因組測(cè)序，在菠菜基因組中鑒定篩選出139個(gè)NBS-LRR基因，并且結(jié)合Irish等[17]對(duì)霜霉病生理小種6抗性基因定位結(jié)果，將標(biāo)記Dm-1定位到第三條連鎖群上，在Dm-1標(biāo)記附近發(fā)現(xiàn)5個(gè)NBS-LRR候選基因，其中2個(gè)NBS-LRR候選基因?yàn)榇?lián)重復(fù)基因。折紅兵等[30]利用同源序列克隆的方法，從菠菜基因組中克隆到22個(gè)NBS-LRR類抗病基因[30]。這些研究為進(jìn)一步克隆抗病基因及研究菠菜的抗病機(jī)理奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

5 菠菜抗性育種工作面臨的問(wèn)題

盡管我國(guó)很早就開(kāi)始了菠菜種質(zhì)資源的收集工作，但缺乏對(duì)資源系統(tǒng)的整理和鑒定，導(dǎo)致很多優(yōu)良的種質(zhì)資源在菠菜育種中無(wú)法被有效利用，尤其是在菠菜抗霜霉病的種質(zhì)資源的篩選、鑒定及利用方面與國(guó)外相比存在較大的差距。目前我國(guó)的菠菜抗病育種研究缺乏抗病種質(zhì)材料、抗病鑒定方法和先進(jìn)的育種手段。因此，廣泛收集及整理國(guó)內(nèi)外的菠菜種質(zhì)資源，篩選針對(duì)不同地區(qū)的抗霜霉病菠菜種質(zhì)資源，加強(qiáng)分子生物學(xué)手段輔助育種及抗病機(jī)理研究，篩選抗病材料，從而培育出抗病品種，是解決菠菜病害的有效途徑。

6 展望

分子標(biāo)記輔助選擇育種是將分子標(biāo)記應(yīng)用于作物品種改良過(guò)程中進(jìn)行選擇的一種輔助手段，可以減少連鎖累贅，獲得期望的個(gè)體，達(dá)到提高育種效率的目的，但在菠菜中該技術(shù)應(yīng)用的較少。當(dāng)前針對(duì)分子技術(shù)的研究也僅局限在菠菜性型基因和抗霜霉病基因的定位上，已篩選到的分子標(biāo)記多為AFLP標(biāo)記，其應(yīng)用有很大的局限性，并且還不能應(yīng)用于準(zhǔn)確鑒定菠菜的性型和抗性。目前隨著菠菜參考基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄本測(cè)序的完成及高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和完善，將會(huì)對(duì)開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，進(jìn)行抗性基因精細(xì)定位和克隆提供支撐，同時(shí)也為分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，將大大促進(jìn)菠菜抗性育種的研究進(jìn)程。

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