兒童復(fù)發(fā)性腮腺炎患者與正常兒童腮腺液微生物群落多樣性的差異

李 瑩 祁森榮 華 琳 尚佳健*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院兒童口腔科， 北京 100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院放射科， 北京 100050；3.首都醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院數(shù)學(xué)與生物信息教研室，北京100069)

兒童復(fù)發(fā)性腮腺炎(juvenile recurrent parotitis，JRP，以下簡稱兒復(fù)腮)是發(fā)生于兒童腮腺的感染性疾病，發(fā)病率僅低于流行性腮腺炎。目前臨床的治療方法，特別是在急性期，主要采取應(yīng)用廣譜抗生素治療，尚無針對性的抗炎治療方法[1]。兒復(fù)腮病因復(fù)雜，發(fā)病機制目前尚不十分清晰，可能與以下因素有關(guān)：細菌或病毒逆行性感染、導(dǎo)管系統(tǒng)發(fā)育異常、遺傳因素、自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)等，其中細菌感染是最主要的原因之一[2]。目前對兒復(fù)腮的細菌學(xué)研究主要使用培養(yǎng)法，而其中一部分微生物，很難或者不能通過傳統(tǒng)的純培養(yǎng)分離方法得到。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從基因?qū)W角度探索口腔微環(huán)境的組成和結(jié)構(gòu)，使越來越多的未培養(yǎng)微生物得以檢測。16SrRNA克隆測序法，為各種微環(huán)境中許多未知菌種的鑒定與分析提供了非培養(yǎng)依賴的方法。近年來該技術(shù)已作為一項新技術(shù)逐漸引入到口腔微生物系統(tǒng)分析中，如牙周病、感染根管的細菌分析。但國內(nèi)尚未見該方法用于兒復(fù)腮的細菌學(xué)檢測中的相關(guān)報道。本研究對兒復(fù)腮患兒的腮腺液進行微生物學(xué)檢測，并分析與正常兒童的差異，有助于了解其病因及發(fā)病機制，為尋找針對性治療方法提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

隨機選取2015年11月20日至2017年3月10日在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院頜面外科涎腺中心就診的兒復(fù)腮患者35例為疾病組(JRP組)，以及在兒童口腔科就診的無腮腺腫脹史的牙體疾病患者12例為對照組(normal children，NC組)。47名受試者中，男性30例，女性17例，年齡3～12歲，平均6.1歲。其中一部分患者取雙側(cè)腮腺液樣本(2個樣本)，一部分患者取單側(cè)腮腺液樣本(由于患兒配合程度和發(fā)病程度有差異)，共獲得60個臨床患者樣本，2例為空白對照樣本，操作方法相同但不收集唾液。

病例組納入標準：1)3～12歲兒童，腮腺反復(fù)腫脹(同一部位腮腺腫脹超過一次)或?qū)Ч芸谟心撔苑置谖?單側(cè)或雙側(cè))者。2)腮腺造影表現(xiàn)為導(dǎo)管末梢點球狀擴張或腮腺超聲表現(xiàn)為腺體內(nèi)點狀或竇狀低回聲區(qū)。3)血常規(guī)檢查結(jié)果顯示白細胞數(shù)增高，淋巴細胞正常者。

正常對照組納入標準：患兒年齡3～12歲。腮腺無腫脹史。排除標準：1)治療依從性差或伴有嚴重的全身性疾病者。2)確診為流行性腮腺炎患兒。3)腮腺只腫脹過一次，無法確診的。

符合要求的病例經(jīng)患兒及家長知情同意，并由家長簽署《知情同意書》后納入本研究。

1.2 臨床檢查

收集每一位患兒的以下臨床資料：姓名、性別、出生日期、聯(lián)系方式、全身疾病情況、抗生素服用情況、主訴、現(xiàn)病史、?？茩z查、影像學(xué)檢查結(jié)果、診斷及治療史、取材情況、采集人等。

1.3 樣本采集

各組兒童腮腺導(dǎo)管口周圍直徑2 cm范圍內(nèi)安爾碘消毒，在導(dǎo)管口處放置無菌消毒小棉粒，直徑約0.5 cm，于口外用手按摩腮腺區(qū)，并從耳后向前擠壓至腮腺導(dǎo)管口處，使擠出的腮腺液完全浸潤小棉粒。取出小棉粒放入無菌試管內(nèi)，-80 ℃冰箱保存。

1.4 提取樣本中DNA，擴增樣本16SrRNA V3-V4區(qū)

利用340F (5′-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3′)[3]和805R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)[4]引物對對樣本微生物16SrRNA V3-V4區(qū)進行PCR擴增。

1.5 文庫構(gòu)建、上機測序和Alpha多樣性指標

使用Illumina Hiseq 2500 PE250高通量測序平臺(北京諾賽基因組研究中心有限公司)對擴增成功樣本的16S-rRNA V3-V4區(qū)進行測序得到原始數(shù)據(jù)，對原始數(shù)據(jù)進行拼接過濾得到有效數(shù)據(jù)，根據(jù)97%的相似性水平對有效數(shù)據(jù)進行歸類，得到多個序列聚類操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)。利用QIIME[5]軟件包中的uclust[6]聚類方法將移除嵌合體后的序列歸為多個OTUs，得到OTU分組情況。然后基于SILVA參考數(shù)據(jù)庫，利用RDP Classifier[7](采用confidence cutoff=0.8)對每個樣品的OTUs進行分類學(xué)(Taxonomy)注釋，并對OTUs進行生物信息分析。

以隨機抽取序列數(shù)為40 000提取Alpha多樣性指標，包括樣品文庫的覆蓋率(goods_coverage)、豐富度指數(shù)(包括Chao1[8]與菌群豐富度指數(shù)(abundance coverage estimator,ACE)、多樣性指數(shù)(包括Shannon等[9]與Simpson[10])、observed_species等。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。兒復(fù)腮患者與正常兒童腮腺液的Alpha多樣性指標的組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本擴增情況

對62個樣本進行DNA提取、擴增，其中50例樣本擴增成功(JRP組34例，NC組16例)，12個樣本(包含2個空白對照樣本)擴增未成功。擴增成功的50個樣本總共獲得 7 303 281條有效數(shù)據(jù)，平均讀長為459個堿基。共得到 19 399個OTUs。

2.2 稀釋性曲線(rarefaction curve)

各樣本的稀釋曲線(圖1)大多趨于平緩，表明大部分物種已經(jīng)被檢測到，實驗得到的數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析。

2.3 Alpha多樣性指標計算

統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，在豐富度指數(shù)(Chao1)、多樣性指數(shù)(Shannon與Simpson)中，除了Simpson兩組比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義，其他指標組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，詳見圖2～4和表1。

圖1 各樣本稀疏曲線Fig.1 The rarefaction curve of samples

The rarefaction curves of most samples tended to be flatten, which indicates that most of species hade been detected and the obtained data could be used for further analysis.

圖2 各樣本Chao1曲線Fig.2 The Chao1 curve of samples

The difference of Chao1 between the disease group and normal group was statistically significant (P<0.001)

圖3 各樣本Shannon指數(shù)曲線Fig.3 The Shannon Index Curve of Samples

The curve of each sample tends to be smooth and reach saturation, which indicates that the sequencing quantity of this experiment can basically reflect the diversity of microflora. In this study, the difference of Shannon index between the disease group and normal group was statistically significant (P<0.01).

圖4 simpson指數(shù)曲線Fig.4 The Simpson index curve of samples

There was no significant difference between the disease group and normal group.

表1 兒童復(fù)發(fā)性腮腺炎患者與正常兒童腮腺液的Alpha多樣性指標比較Tab.1 Comparison of Alpha diversity in parotid fluid between JRP and the normal children index

2.4 微生物構(gòu)成的豐度排序(屬水平)

JRP組按豐度高低排名前5位的微生物為：鏈球菌屬、嗜血桿菌屬、 奈瑟氏菌屬、孿生球菌屬、氏菌屬。NC組的排序為：鏈球菌屬、嗜血桿菌屬、孿生球菌屬、奈瑟氏菌屬、羅氏菌屬。

3 討 論

在本研究中，12個樣本擴增未成功。其中2例空白樣本均未擴增成功，可以說明獲取樣本方法可靠，沒有可檢測出來的生物污染。另外10個樣本(JRP組2例，NC組8例)未擴增成功的原因可能是腮腺液內(nèi)微生物含量低或者是取樣本時所獲得的腮腺液較少。

口腔是消化道的起始端，口腔微生物群落是指定植于人體口腔的微生物集合[11]。2008年人類口腔微生物組數(shù)據(jù)庫(the human oral microbiome database, HOMD)正式啟動，該數(shù)據(jù)庫主要建立在16SrRNA檢測的基礎(chǔ)上，記錄了13門619種口腔微生物的分類[12]。徐欣等[13]通過收集不同年齡、不同牙列階段的臨床樣本進行細菌學(xué)檢測，結(jié)果顯示人群中口腔微生物的分布模式差異存在統(tǒng)計學(xué)意義；隨著年齡改變，口腔細菌在“門”水平呈現(xiàn)動態(tài)改變；嬰兒口腔內(nèi)的微生物多樣性較成人低。腮腺結(jié)構(gòu)和功能存在個體差異，腮腺導(dǎo)管開口于口腔內(nèi)，口內(nèi)微生物可進入腮腺導(dǎo)管系統(tǒng)。不同個體腮腺微生物是否具有多樣性差異，相關(guān)研究較少。本實驗通過研究口腔生物群落的多樣性，希望深入理解口腔微生物與疾病之間的相互作用關(guān)系。

人體口腔微生物群落的穩(wěn)定是指不同種群間達到動態(tài)的生態(tài)平衡的結(jié)果[14]。當口腔微生物群落與宿主處于平衡狀態(tài)時，發(fā)揮屏障作用，阻止外源性致病菌的入侵；當平衡狀態(tài)被破壞時，可能會發(fā)生口腔疾病[15]。口腔微生物還可作為病灶，與全身系統(tǒng)性疾病關(guān)系密切。Becker等[16]對齲病微生物多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)多種細菌的組成和結(jié)構(gòu)在齲病患者與無齲人群之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義, 國內(nèi)研究[17]也有相同結(jié)論。臨床研究[1]顯示兒復(fù)腮患兒的腮腺腫脹發(fā)作與上呼吸道感染等疾病相關(guān)，目前普遍認為微生物是從口腔逆行進入腮腺導(dǎo)管系統(tǒng)，導(dǎo)致腮腺炎性反應(yīng)的發(fā)生。本研究顯示正常兒童腮腺內(nèi)有復(fù)雜的微生物環(huán)境。兒復(fù)腮患兒腮腺液中豐度較高的細菌都可以在正常兒童腮腺內(nèi)發(fā)現(xiàn)，說明兒復(fù)腮可能是由條件致病菌參與的感染性炎性反應(yīng)，而且致病菌可能并非是在患病時由口腔內(nèi)逆行進入腮腺內(nèi)的。

本研究把兒復(fù)腮患者與正常兒童腮腺液兩組樣本的微生物群落分別作為一整體，研究兩組之間的Alpha多樣性指標的差異。Alpha多樣性指標包括：Goods-coverage、豐富度指數(shù)(Chao1與ACE)、多樣性指數(shù)(Shannon與Simpson)、Observed_species等。其中Goods_coverage表示各樣品文庫的覆蓋率，本實驗中各樣本的覆蓋率均達到97%以上；豐富度指數(shù)衡量樣本中物種種類個數(shù)；多樣性指數(shù)用來衡量微生物群落的異質(zhì)性，其中ACE是用來估計群落中含有 OTU 數(shù)目的指數(shù)；Observed_species表示樣品中OTU的個數(shù)。本研究結(jié)果表明兒復(fù)腮患者組中微生物群落的豐富度、多樣性低于正常兒童組。提示兒復(fù)腮不僅僅是單一菌種感染致病，而是腮腺內(nèi)原有條件致病菌占比增多造成生態(tài)關(guān)系失衡的結(jié)果[18]。

采用廣譜抗生素全身治療，可能會進一步干擾菌群關(guān)系的平衡。李琰[19]的研究顯示中藥長皮膏在治療慢性下肢靜脈性潰瘍中療效顯著，分析機制可能是治療增加了創(chuàng)面菌種的多樣性，通過競爭性生長，弱化致病菌的致病作用，促進潰瘍面的愈合。兒復(fù)腮臨床治療中碘化油導(dǎo)管灌注的臨床效果較好，原因可能是碘化油為廣譜抑菌劑，有利于抑制致病菌，恢復(fù)正常菌群環(huán)境[20]。因此兒復(fù)腮的治療策略需要將患兒與微生物群落作為一整體加以考慮，以恢復(fù)或重建適宜的腮腺微生態(tài)環(huán)境為目標。

微生物群落的失衡是導(dǎo)致口腔多種感染性疾病的重要因素，如齲病[21]、牙周疾病[22-23]等，本研究提示兒復(fù)腮也具有相同機制。治療策略及預(yù)防復(fù)發(fā)以恢復(fù)或重建的腮腺微生態(tài)環(huán)境為目標。兒復(fù)腮患者腮腺內(nèi)菌群失衡的機制及主要致病菌的構(gòu)成、豐度等仍需進一步研究。

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