重型血友病A患兒關(guān)節(jié)出血后IL-1β、IL-6、TNF-α釋放與關(guān)節(jié)病變形成的相關(guān)性研究

劉國(guó)青 陳振萍 唐 凌 吳心怡 甄英姿 李 剛 王 巖 張寧寧 張紀(jì)水 于國(guó)霞 吳潤(rùn)暉

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院血液腫瘤中心 兒童血液病與腫瘤分子分型北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 兒科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科 教育部?jī)和卮蠹膊≈攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100045)

血友病A是一種由凝血因子Ⅷ缺乏所致X染色體連鎖的先天性出血性疾病，發(fā)病率為每5 000例活產(chǎn)男嬰中發(fā)病1例。盡管血友病的相關(guān)治療取得了很大的進(jìn)展，關(guān)節(jié)病變作為血友病關(guān)節(jié)出血后的第一合并癥，其發(fā)生發(fā)展仍未得到有效預(yù)防和治療，關(guān)節(jié)炎甚至關(guān)節(jié)殘疾的出現(xiàn)影響著許多患者(尤其是患兒)的身心健康[1-2]。世界血友病聯(lián)盟(World Federation of Hemophilia, WFH)將預(yù)防治療推薦為重型血友病的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。預(yù)防治療的優(yōu)勢(shì)及有效性已得到公認(rèn)，但是研究[3]也顯示，雖然預(yù)防治療可以降低出血事件的發(fā)生概率，一旦血友病性關(guān)節(jié)病形成，就不可再逆轉(zhuǎn)，此時(shí)預(yù)防治療只能延緩關(guān)節(jié)病的進(jìn)展。

臨床觀察[4]顯示，相同出血情況下，關(guān)節(jié)病的形成與否、嚴(yán)重程度存在個(gè)體差異，提示除關(guān)節(jié)出血因素外，存在其他影響因素參與血友病關(guān)節(jié)病的形成。血友病關(guān)節(jié)出血后血液對(duì)關(guān)節(jié)軟骨具有直接侵蝕作用：血液充滿關(guān)節(jié)腔后激活單核/巨噬系統(tǒng)釋放白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)等細(xì)胞因子，導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)分泌增加，誘發(fā)滑膜肥大和新生血管生長(zhǎng)，形成滑膜炎性反應(yīng)；出血后滑膜內(nèi)的鐵沉積導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷和死亡，最終造成整個(gè)關(guān)節(jié)的退行性變和功能障礙[3，5-6]。而風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也有類(lèi)似的過(guò)程，因此人們普遍認(rèn)為，血友病關(guān)節(jié)出血后的關(guān)節(jié)病發(fā)病機(jī)制及過(guò)程類(lèi)似于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎退行性變軟骨的破壞過(guò)程[1]。

在其他炎性關(guān)節(jié)病變，尤其是風(fēng)濕免疫病領(lǐng)域中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)炎與炎性反應(yīng)因子的關(guān)系，尤其是IL-1β、IL-6、TNF-α，并且抗細(xì)胞因子的藥物如抗IL-1β、IL-6、TNF-α的靶向藥物已經(jīng)成功的應(yīng)用于預(yù)防風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的慢性關(guān)節(jié)病變。近幾年，人們通過(guò)體外細(xì)胞和小鼠模型的研究，可以得知IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性反應(yīng)因子在血友病關(guān)節(jié)病變的形成過(guò)程中起著重要作用[7]，但究竟炎性反應(yīng)因子在關(guān)節(jié)出血后關(guān)節(jié)病變形成過(guò)程中如何作用至今仍不清楚，故本研究主要探討血友病患兒不同關(guān)節(jié)出血期炎性反應(yīng)因子的表達(dá)情況，通過(guò)觀察不同關(guān)節(jié)出血時(shí)期IL-1β、IL-6、TNF-α的血清蛋白濃度，以及外周單個(gè)核細(xì)胞中mRNA表達(dá)的情況，從血清水平和基因表達(dá)水平得到一個(gè)變化規(guī)律，尋找患兒關(guān)節(jié)病變形成過(guò)程中的主要因素，為更好地了解關(guān)節(jié)出血后關(guān)節(jié)病變形成的機(jī)制，為之后關(guān)節(jié)病變的用藥和治療提供可靠的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2015年10月至2016年4月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院血友病門(mén)診常規(guī)篩查抑制物處于不同關(guān)節(jié)出血分期的47例血友病患兒作為研究組。所有入組患者均簽署知情同意書(shū)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡2～18歲；(2)重型血友病患兒；(3)沒(méi)有抑制物產(chǎn)生病史；(4)沒(méi)有危重部位出血；(5)常規(guī)篩查抑制物后留取足夠殘留血標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<2歲或>18歲；(2)抑制物陽(yáng)性；(3)伴有類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)病、骨關(guān)節(jié)炎、混合性結(jié)締組織病、銀屑病等自身免疫系統(tǒng)疾?。?4)各種感染病的急性期；(5)近期服用過(guò)抗炎鎮(zhèn)痛藥物；(6)病程中曾服用過(guò)免疫制劑。

1.2 相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)及定義[6]

(1)關(guān)節(jié)出血：關(guān)節(jié)的異常感覺(jué)并滿足以下任意一條：①關(guān)節(jié)表面皮膚進(jìn)行性腫脹或皮膚溫度進(jìn)行性升高；②疼痛加?。虎叟c原來(lái)相比，關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍進(jìn)行性縮小或肢體活動(dòng)困難加劇。在嬰兒和小幼兒如果出現(xiàn)唯獨(dú)不愿活動(dòng)的肢體，可能提示關(guān)節(jié)或肌肉出血。(2)重型血友病A：患兒血漿因子FⅧ活性水平<1%。(3)關(guān)節(jié)病變：血友病性關(guān)節(jié)病是由于關(guān)節(jié)反復(fù)出血而引起的關(guān)節(jié)滑膜、軟骨及軟骨下骨的一系列病理改變。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

分為以下3組：(1)無(wú)關(guān)節(jié)出血(non-joint bleeding, NJB) 組：3個(gè)月內(nèi)無(wú)關(guān)節(jié)出血；(2)急性關(guān)節(jié)出血 (acute joint bleeding, AJB)組：1個(gè)月內(nèi)有關(guān)節(jié)出血；(3)慢性關(guān)節(jié)出血(chronic joint bleeding, CJB) 組：3個(gè)月內(nèi)有關(guān)節(jié)出血，1個(gè)月內(nèi)無(wú)關(guān)節(jié)出血。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1)臨床資料收集：收集患兒年齡及關(guān)節(jié)出血時(shí)間。

2)標(biāo)本收集：紫帽管(EDTA抗凝)收集患兒靜脈血標(biāo)本，保證在采集后2 h內(nèi)處理標(biāo)本。

3)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)： ①應(yīng)用ELISA法測(cè)定血清中IL-1β、IL-6、TNF-α細(xì)胞因子的濃度。收取外周血標(biāo)本，用離心機(jī)3 000 r/min離心25 min，收集血清，放入-70°低溫冰箱保存?zhèn)溆?。用ELISA法測(cè)定血清中IL-1β、IL-6、TNF-α細(xì)胞因子的濃度。 ②外周單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及用RT-PCR測(cè)定IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)量。收取外周血標(biāo)本，裂解紅細(xì)胞，洗滌單個(gè)核細(xì)胞，Trizol法提取分選細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RNA純度與濃度的測(cè)定，加RNA 2 μg，Random Primers 1 μL, 補(bǔ)Rnase Free Water至12.5 μL，70 ℃ 5 min；反轉(zhuǎn)錄第二步上機(jī)(PCR儀)：每12.5 μL產(chǎn)物中加M-MLV 5×Buffer 5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)5 μL，RnaseSin 0.5 μL，M-MLV 1 μL。37 ℃ 60 min。cDNA終濃度為80 ng/μL。將1 μg細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)NCBI基因庫(kù)描述的IL-1β、IL-6、TNF-α基因序列，設(shè)計(jì)IL-1β、IL-6、TNF-α、β-actin引物序列如表1，每次實(shí)驗(yàn)用無(wú)酶水代替cDNA，作為PCR陰性對(duì)照。擴(kuò)增體系：cDNA 1 μL、PCR Master MIX 5 μL、滅菌注射用水3 μL，上游引物(2.5 μmol/L) 0.5 μL、下游引物(2.5 μmol/L) 0.5 μL，IL-1β、IL-6、TNF-α和β-actin用染料法進(jìn)行熒光相對(duì)定量PCR，ABI ViiA7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上機(jī)，程序?yàn)椋?5 ℃ 15 min，95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(35個(gè)循環(huán))，收集數(shù)據(jù)。③用到的公式：目的基因mRNA=2-△△Ct[△△Ct=(待測(cè)樣本目的基因平均Ct-待測(cè)樣本內(nèi)參基因平均Ct)—(對(duì)照樣本目的基因平均Ct-對(duì)照樣本內(nèi)參基因平均Ct)]。

表1 RT-PCR的引物序列Tab.1 Primer sequences

TNF-α：tumor necrosis factor-α；IL-6：interleukin-6；IL-1β：interleukin-1β.

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料

入組患兒47例，其中AJB組17例(伴關(guān)節(jié)病變8例，不伴關(guān)節(jié)病變9例)，CJB組13例，NJB組17例?；純褐形荒挲g5.5(2～18)歲。

2.2 關(guān)節(jié)出血后炎性反應(yīng)因子變化情況

1)關(guān)節(jié)出血組與無(wú)關(guān)節(jié)出血組相比，IL-1β、IL-6及TNF-α血清濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)水平均升高，其中以TNF-α升高為主且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)；即血友病患兒關(guān)節(jié)出血后IL-1β、IL-6及TNF-α表達(dá)水平均升高，其中以TNF-α升高為主；2)急性出血期與無(wú)關(guān)節(jié)出血組比較，IL-1β、IL-6及TNF-α血清濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-6及TNF-α的mRNA的表達(dá)水平均值升高，其中以TNF-α升高為主且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)；3)慢性出血組與無(wú)關(guān)節(jié)出血組比較，僅細(xì)胞內(nèi)TNF-α的mRNA的表達(dá)水平升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)；4)急性出血期與慢性出血期的L-1β、IL-6及TNF-α血清表達(dá)濃度及細(xì)胞內(nèi)mRNA的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2～4。

GroupBlood serumNumber of caseValue/(pg·mL-1)Expression of mRNANumber of caseValueNJB1610.528±5.078160.376±0.364JB2813.115±9.912270.764±1.146AJB1613.566±9.119160.980±1.425CJB1212.514±11.273110.450±0.432 IL-1β:interleukin-1β;NJB: non-joint bleeding;JB:joint bleeding; AJB:acute joint bleeding; CJB:chronic joint bleeding.

GroupBlood serumNumber of caseValue/(pg·mL-1)Expression of mRNANumber of caseValueNJB150.615±1.416150.224±0.380JB280.891±1.940260.372±0.781AJB160.963±2.055160.419±0.962CJB120.797±1.861100.298±0.380 IL-6:interleukin-6;NJB: non-joint bleeding;JB:joint bleeding; AJB:acute joint bleeding; CJB:chronic joint bleeding.

GroupBlood serumNumber of caseValue/(pg·mL-1)Expression of mRNANumber of caseValueNJB1613.346±3.296171.066±0.815JB2816.012±8.863*302.866±2.750*AJB1616.207±10.775*173.517±3.328*CJB1215.753±5.862132.014±1.456* *P<0.05 vs NJB group;TNF-α:tumor necrosis factor-α;NJB: non-joint bleeding;JB:joint bleeding; AJB:acute joint bleed-ing; CJB:chronic joint bleeding.

2.3 關(guān)節(jié)病變的患兒炎性反應(yīng)因子表達(dá)水平

血清水平：AJB組伴關(guān)節(jié)病變與AJB組不伴關(guān)節(jié)病變的IL-1β的血清表達(dá)水平(12.976±6.100vs14.024±11.287)，IL-6的血清表達(dá)水平(0.162±0.487vs1.991±2.836)及TNF-α的血清表達(dá)水平(20.250±15.770vs13.062±2.390)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.828、0.140、0.276)(圖1)。

細(xì)胞內(nèi)mRNA的水平：AJB組伴關(guān)節(jié)病變與AJB組不伴關(guān)節(jié)病變的IL-1β的mRNA表達(dá)水平(1.542±1.879vs0.4718±0.317)，IL-6的mRNA表達(dá)水平(0.125±0.612vs0.647±1.263)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.137和0.250)；TNF-α的mRNA表達(dá)水平(5.584±3.634vs1.680±1.590)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02)(圖2)。

圖1 AJB組伴與不伴關(guān)節(jié)病變患兒的IL-1β、IL-6、TNF-α的血清蛋白表達(dá)水平Fig.1 The levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α inblood serum between AJB group with arthropathy and AJB group without arthropathy

AJB:acute joint bleeding;IL-1β:interleukin-1β;IL-6:interleukin-6;TNF-α:tumor necrosis factor-α.

圖2 AJB組伴與不伴關(guān)節(jié)病變患兒的IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)水平Fig.2 The levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α mRNAbetween AJB group with arthropathy and AJB groupwithout arthropathy

AJB:acute joint bleeding;IL-1β:interleukin-1β;IL-6:interleukin-6;TNF-α:tumor necrosis factor-α;There was significant difference in the expression of mRNA of TNF-α between AJB group with arthropathy (P=0.02).

3 討論

血友病是一種X染色體連鎖的先天性出血性疾病。該病由于凝血因子Ⅷ/Ⅸ缺乏，導(dǎo)致患兒異常出血，其中以關(guān)節(jié)出血為主，嚴(yán)重的出血可致死，凝血因子替代治療后，該疾病由致死性疾病變?yōu)橹職埿约膊8]。重度血友病患者中82%的出血事件發(fā)生在關(guān)節(jié)，膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)及肘關(guān)節(jié)占了所有關(guān)節(jié)出血的80%，反復(fù)出血最終將形成血友病關(guān)節(jié)病變，引起疼痛和導(dǎo)致永久性功能障礙[9-10]。

炎性細(xì)胞因子被認(rèn)為參與人類(lèi)炎性關(guān)節(jié)炎的形成。TNF-α是有效的前炎性反應(yīng)因子蛋白，Ji等[11]提出TNF-α在關(guān)節(jié)炎性病變中起著重要的作用。國(guó)外研究[1]已證實(shí)TNF-α在小鼠模型的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)病的形成中起到重要作用，如K/BxN模型中TNF-α目標(biāo)失活的小鼠中關(guān)節(jié)病變的概率降低。近期TNF-α抑制劑藥物也開(kāi)始試用于硬皮病的臨床治療中。細(xì)胞因子中的TNF-α是炎性反應(yīng)的誘發(fā)因子。近幾年人們通過(guò)體外細(xì)胞和小鼠模型的研究[11-12]，可以得知TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10等炎性反應(yīng)因子在血友病關(guān)節(jié)病變的形成過(guò)程中起著重要作用。Forsyth等[13]提出血友病關(guān)節(jié)出血后，實(shí)際的機(jī)械損傷引發(fā)的出血可能微乎其微，而促炎性細(xì)胞因子(特別是TNF-α、IL-1β、IL-6)通常作為組織修復(fù)因子，巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞來(lái)增生擴(kuò)增，隨著鐵、成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞增生，對(duì)滑膜和軟骨組織造成進(jìn)一步破壞，在關(guān)節(jié)內(nèi)出血后進(jìn)行正常傷口愈合時(shí)大大地延長(zhǎng)了正常的生理時(shí)間，導(dǎo)致了病理性的結(jié)果而不是生理性的修復(fù)。

本研究顯示關(guān)節(jié)出血期TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而TNF-α血清蛋白可見(jiàn)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮本研究標(biāo)本均用臨床檢測(cè)因子抑制物剩余標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)取血時(shí)間和標(biāo)本收取存在困難，而TNF-α血清蛋白容易裂解，不穩(wěn)定，故認(rèn)為mRNA表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，結(jié)果更加可信，故關(guān)節(jié)出血期TNF-α升高。

本研究顯示急性關(guān)節(jié)出血期伴關(guān)節(jié)病變與不伴關(guān)節(jié)病變的患兒相比較，TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而未見(jiàn)其他因子的升高，故認(rèn)為T(mén)NF-α在關(guān)節(jié)病變時(shí)會(huì)升高，是關(guān)節(jié)病變形成的關(guān)鍵因子。

本研究還顯示，關(guān)節(jié)出血慢性期TNF-α的mRNA高于無(wú)關(guān)節(jié)出血組，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而IL-1β、IL-6未見(jiàn)明顯升高，可見(jiàn)TNF-α在急性期及慢性期持續(xù)升高，并且在伴關(guān)節(jié)病變的患兒中升高明顯，故認(rèn)為T(mén)NF-α是血友病慢性滑膜炎形成中的關(guān)鍵炎性因子，并且在慢性關(guān)節(jié)病變形成過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

雖然血友病關(guān)節(jié)病變的機(jī)制仍不甚明確，但是人們逐漸認(rèn)識(shí)到血友病關(guān)節(jié)病變是血友病患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)頻繁出血引起的軟骨退行性變和滑膜炎性反應(yīng)[14-15]，因此探討關(guān)節(jié)病變和炎性反應(yīng)因子的關(guān)系，可尋找有效控制關(guān)節(jié)病變進(jìn)展的靶點(diǎn)藥物，以提高血友病關(guān)節(jié)病變的防治水平。而本研究顯示，關(guān)節(jié)出血后炎性反應(yīng)因子釋放升高，并且在關(guān)節(jié)出血慢性期仍可見(jiàn)TNF-α明顯升高，同時(shí)伴關(guān)節(jié)病變的患兒的TNF-α表達(dá)水平較不伴關(guān)節(jié)病變者明顯升高，故認(rèn)為T(mén)NF-α可能參與了慢性關(guān)節(jié)病變的形成，而其他炎性反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎中，尤其是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，細(xì)胞因子TNF-α已經(jīng)成為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要藥物靶點(diǎn)，TNF-α抑制劑在臨床中也廣泛應(yīng)用。因此，筆者期待如同目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療一樣，將TNF-α抗體用于血友病性關(guān)節(jié)病的治療，為預(yù)防血友病性關(guān)節(jié)病變提供新的治療方向和思路。

但本研究也存在局限性，本研究的入組患者的年齡并不均等，主要是急性出血期伴靶關(guān)節(jié)病變的患兒一般均為年齡較大患兒，故年齡出現(xiàn)明顯不均等， 而兒童的細(xì)胞因子水平與年齡無(wú)關(guān)，故考慮本研究中年齡對(duì)于細(xì)胞因子水平的影響不大，同時(shí)本研究為橫斷面研究，未進(jìn)行隨訪調(diào)查研究，且病例研究數(shù)量少，因此，需要前瞻性、大樣本、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等研究進(jìn)一步證實(shí)。

結(jié)論：重型血友病A患兒關(guān)節(jié)出血急性期IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)升高，以TNF-α升高為主，慢性期只見(jiàn)TNF-α表達(dá)升高，伴有關(guān)節(jié)病變的患兒TNF-α表達(dá)水平明顯升高，故TNF-α是關(guān)節(jié)病變形成的關(guān)鍵因子。

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