茶樹(shù)CsIDI1和CsIDI2基因的克隆及其表達(dá)分析

陳 丹 ，王鵬杰，陳 笛，王 贊，岳 川，孫 云，陳桂信，葉乃興

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院,茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002)

茶葉香氣是茶葉審評(píng)中評(píng)價(jià)茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，也是吸引消費(fèi)者和提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的重要因子[1]。茶葉香氣物質(zhì)按化學(xué)結(jié)構(gòu)劃分，可分為萜烯類及其衍生物、脂肪族類及其衍生物、芳香族衍生物、含氮氧等雜環(huán)類及其他化合物。其中萜烯類化合物是茶葉中重要的呈香物質(zhì)，大多具有獨(dú)特的香氣特征，如呈甜花香的芳樟醇、玫瑰花香的香葉醇，甘甜橙花香的橙花叔醇、花香的α-法尼稀，紫羅蘭香的紫羅蘭酮系化合物等[2-4]。

萜類化合物的合成途徑主要有兩條，分別是細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway，MVA)和質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway，MEP)。五碳(C5)的異戊烯基焦磷酸(IPP)和其異構(gòu)體——二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)是萜類化合物合成的中心化合物和重要前體分子，是通過(guò)兩條位于不同亞細(xì)胞空間的途徑合成的，但這兩條途徑并非孤立存在，煙草、擬南芥和金魚(yú)草等植物的IPP在胞質(zhì)和質(zhì)體之間交互使用[5]。在萜類化合物的合成過(guò)程中，異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(IDI)催化常見(jiàn)的萜烯前體物質(zhì)異戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)相互轉(zhuǎn)化，表明IDI在底物分配中起作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的DMAPP/IPP穩(wěn)態(tài)比率，影響異戊二烯(C5)的產(chǎn)量生產(chǎn)和速率，因此IDI家族基因成為動(dòng)植物、微生物萜類代謝途徑中的一個(gè)研究關(guān)注點(diǎn)[6]。目前在擬南芥[7]、玉米[8]、煙草[9]等植物中均已克隆得到IDI基因，并發(fā)現(xiàn)植物IDI基因家族有兩條相似性很高的IDI1和IDI2基因，IDI1比IDI2在N端有明顯的一段延伸氨基酸片段。Kajiwara等[10]在經(jīng)過(guò)代謝途徑改造的大腸桿菌中導(dǎo)入外源IDI基因，結(jié)果使重組后的大腸桿菌中多種萜類化合物含量提高。Sun等[11]在單細(xì)胞綠藻中導(dǎo)入外源IDI基因，導(dǎo)致細(xì)胞中類胡蘿卜素大量積累，并且含量與IDI基因表達(dá)量呈正相關(guān)，表明IDI基因在萜類物質(zhì)生物合成中是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子，它的超量表達(dá)，利于代謝流向下游流動(dòng)，促進(jìn)下游萜類產(chǎn)物的生物合成。

本研究以鐵觀音芽葉為材料，克隆了茶樹(shù)IDI家族基因CsIDI1和CsIDI2。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，研究CsIDI1和CsIDI2在茶樹(shù)不同組織、不同茶樹(shù)品種以及烏龍茶做青過(guò)程中的表達(dá)模式，為研究茶樹(shù)萜類香氣物質(zhì)形成中茶樹(shù)IDI家族基因的作用提供理論參考，為實(shí)現(xiàn)茶樹(shù)萜類香氣代謝基因工程提供候選基因和作用靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2016年10月至2017年5月，于福建農(nóng)林大學(xué)教學(xué)茶場(chǎng)中采集3種供試材料：(1)采用鐵觀音茶樹(shù)植株中小開(kāi)面二三葉嫩梢的第二葉、老葉、莖、花和種子，作為茶樹(shù)地上部位不同組織材料。(2)采用母本鐵觀音、父本黃旦以及兩者雜交后代(金玫瑰、金牡丹、金觀音和黃觀音4個(gè)高香型烏龍茶茶樹(shù)品種)植株中小開(kāi)面二三葉作為不同茶樹(shù)品種材料。(3)以鐵觀音茶樹(shù)中小開(kāi)面嫩梢為原料，按照閩南烏龍茶加工工藝付制[12]，在此過(guò)程中取鮮葉、曬青葉、一搖后、二搖后、三搖后和殺青前各工序的烏龍茶在制品作為烏龍茶做青過(guò)程材料。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，錫箔紙包裹標(biāo)記，液氮速凍后置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成使用天根多糖多酚植物RNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書操作步驟提取茶樹(shù)總RNA。使用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，用1%凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，使用全式金Easyscript One-step gDNA Removal and cDNA synthesis superMix試劑盒合成cDNA用于RT-PCR和qRT-PCR。

1.2.2茶樹(shù)CsIDI1和CsIDI2基因克隆在課題組前期鐵觀音茶樹(shù)芽葉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)庫(kù)中，篩選出2條與IDI高度一致的EST序列，經(jīng)NCBI-Blast 比對(duì)，具有完整開(kāi)放閱讀框(ORF)，并設(shè)計(jì)RT-PCR引物(表1)。RT-PCR擴(kuò)增參考姚雪倩等[13]的方法。后續(xù)克隆試驗(yàn)參照俞瀅等[14]的方法進(jìn)行，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序后，得到2條包含完整ORF的CsIDI1和CsIDI2 cDNA序列。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.3茶樹(shù)CsIDI1和CsIDI2的生物信息學(xué)分析NCBI在線查找CsIDI1和CsIDI2基因ORF和同源性分析；采用ProtParam、SignalP 4.1 Server、TargetP、Wolf Psort、NetPhos 3.1 Serve、SOPMA和SWISS-MODEL軟件，分別對(duì)CsIDI1和CsIDI2蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，用Pymol軟件編輯輸出三級(jí)結(jié)構(gòu)；采用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)；在MEGA5.0軟件中用鄰近相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4CsIDI1和CsIDI2實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析根據(jù)CsIDI1和CsIDI2 cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物 (表1)。以鐵觀音不同組織部位、不同茶樹(shù)品種、烏龍茶做青過(guò)程的樣品總RNA為模板，使用全式金的Easyscript One-step gDNA Removal and cDNA synthesis superMix試劑盒合成cDNA作為熒光定量PCR模板，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。以茶樹(shù)Actin、TBP、EF1為內(nèi)參基因，使用Bio-Rad的CFX96 Touch熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系參照Transstart?Tip Green qPCR superMix試劑盒的方法，反應(yīng)程序：94 ℃，30 s；94 ℃，5 s；60 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)結(jié)果釆用2-ΔΔt算法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsIDI1和CsIDI2基因克隆及序列分析

以鐵觀音芽葉cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得茶樹(shù)包含完整ORF的CsIDI1和CsIDI2 cDNA全長(zhǎng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)長(zhǎng)度結(jié)果(圖1)與預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果拼接后顯示其具有完整的ORF，在NCBI中用Blastx比對(duì)顯示，序列編碼完整的異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(IDI)，與其他植物的IDI基因相似度極高，命名為CsIDI1和CsIDI2。CsIDI1全長(zhǎng)1 378 bp，其中包含894 bp開(kāi)放閱讀框(ORF，78～972 bp)，編碼297個(gè)氨基酸；CsIDI2全長(zhǎng)1 216 bp，其中包含717 bp開(kāi)放閱讀框(ORF，195～911 bp)，編碼238個(gè)氨基酸(圖1)

M. DL2000

2.2 CsIDI1和CsIDI2蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析

利用ProtParam對(duì)CsIDI1基因編碼的蛋白的特征進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)相對(duì)分子量為33.94 kD，分子式為C1503H2384N418O455S11；含酸性氨基酸(Asp+Glu)40個(gè)，堿性氨基酸(Arg+Lys)37個(gè)，理論等電點(diǎn)6.2，屬酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為 40.18，表明該蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定。CsIDI2相對(duì)分子量為27.21 kD，分子式為C1213H1900N328O363S10；含酸性氨基酸(Asp+Glu)41個(gè)，堿性氨基酸(Arg+Lys)28個(gè)，理論等電點(diǎn)4.93，屬酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為 23.83，表明該蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定。

TargetP1.1中的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CsIDI1的cTP、mTP、SP和other 的預(yù)測(cè)值分別為 0.960、0.286、0.001和0.008，Loc預(yù)測(cè)位點(diǎn)是葉綠體，RC為2，表明該基因定位在葉綠體的可能性較大。CsIDI2的cTP、mTP、SP和other 的預(yù)測(cè)值分別為0.053、0.111、0.120和0.886，RC為2，表明該基因定位預(yù)測(cè)在除葉綠體、線粒體外的其他位置的可能性較大。Signal P4.1 中的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CsIDI1和CsIDI2該序列中不含信號(hào)肽輸出位點(diǎn)。WoLF PSORT預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示CsIDI1其定位在葉綠體、線粒體和細(xì)胞核的K值分別為7.5、5.5和1，說(shuō)明該基因定位在葉綠體上的可能性最大。CsIDI2其定位在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和細(xì)胞核的K值分別為8、5和1，說(shuō)明該基因定位在細(xì)胞質(zhì)上的可能性最大。

在NetPhos 3.1 Server 中對(duì)CsIDI1所含磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該序列含37 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中22 個(gè)絲氨酸(Ser)位點(diǎn)、10 個(gè)蘇氨酸(Thr)和5 個(gè)絡(luò)氨酸(Tyr)位點(diǎn)，約占全序列的 12.5%，主要能夠被cdc2、PKC、unsp、PKA等蛋白激酶磷酸化。CsIDI2序列含14 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中7 個(gè)絲氨酸(Ser)位點(diǎn)、3 個(gè)蘇氨酸(Thr)和4 個(gè)絡(luò)氨酸(Tyr)位點(diǎn)，約占全序列的 12.5%，主要能夠被unsp、CKII、p38MAPK等蛋白激酶磷酸化。

2.3 CsIDI1和CsIDI2蛋白結(jié)構(gòu)分析

SOPMA分析顯示，CsIDI1和CsIDI2蛋白主要以α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成，CsIDI1中分別占41.41%、33%、21.21%、4.38%；CsIDI2中分別占48.74%、28.57%、16.81%、5.88%。應(yīng)用SWISS-MODEL模擬蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，CsIDI1與CsIDI2蛋白與人類IDI蛋白相似度高達(dá)54.79%和54.17%，并基于此建模。GMQE分值為0.64和0.76，說(shuō)明該模型建立的可信度較高。通過(guò)Pymol軟件編輯輸出3D結(jié)構(gòu)，它們的結(jié)構(gòu)相似性較高，其有典型的NUDIX水解酶結(jié)構(gòu)域(圖2)。

2.4 CsIDI1和CsIDI2的同源比對(duì)和蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

在NCBI中對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行BLASTx同源比對(duì)，結(jié)果顯示CsIDI1與桂花(AOT86864.1)、葡萄(NP_001304059.1)、荷花(XP_010260544.1)和蘋果(XP_008355853.1)CsIDI1的氨基酸序列相似性分別達(dá)到94%、95%、92%和92%；CsIDI2與黃芪(AID51443.1)、煙草(XP_009608528.1)、番木瓜(XP_021896057.1)和芝麻(XP_011084658.1)等植物的CsIDI2的相似性分別達(dá)到95%、95%、95%和96%。氨基酸序列同源比對(duì)結(jié)果(圖3)顯示，CsIDI1和CsIDI2蛋白與其他植物中的相應(yīng)IDI序列相似性較高，但 N-端序列的保守性較低。保守性較高區(qū)域?yàn)镮DI的功能域，有高度保守的NUDIX水解酶域，CsIDI1的NUDIX水解酶域在114～264氨基酸位點(diǎn)，CsIDI2的NUDIX水解酶域在55～205氨基酸位點(diǎn)，以及2個(gè)重要的保守酶活性位點(diǎn)C(半胱氨酸)和E(谷氨酸)。與CsIDI2相比，CsIDI1在N-端有一段較長(zhǎng)的延伸氨基酸片段。

選取不同植物中的CsIDI1和CsIDI2構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果顯示茶樹(shù)CsIDI1與CsIDI2聚為一類，且與橡膠的親緣關(guān)系最近(圖4)。

2.5 CsIDI1和CsIDI2 的表達(dá)分析

2.5.1CsIDI1和CsIDI2的組織表達(dá)特異性分析采用熒光定量PCR檢測(cè)了CsIDI1和CsIDI2基因在茶樹(shù)莖、嫩葉、老葉、花及種子中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，CsIDI1和CsIDI2在茶樹(shù)所有組織中都能檢測(cè)到表達(dá)，但在不同組織中的表達(dá)量差異較大。CsIDI1表達(dá)水平從高到低依次為：花>老葉>嫩葉>莖>種子；CsIDI2表達(dá)水平從高到低依次為：種子>老葉>嫩葉>莖>花(圖5，A)。

紅色區(qū)域表示CsIDI1和CsIDI2高度保守的NUDIX水解酶域The conserved NUDIX hydrolase domain of CsIDI1 and CsIDI2 proteins with color of red

CsIDI1、CsIDI2.茶樹(shù)IDI ；AtIDI1、AtIDI2.擬南芥IDI(AAB67741.1和AAL57687.1)；NtIDI1、NtIDI2.煙草IDI(BAB40973.1和BAB40974.1) ；方框顯示IDI 的2個(gè)催化酶活性位點(diǎn)CsIDI1 and CsIDI2 of Camellia sinensis IDI ；AtIDI1 and AtIDI2 of Arabidopsis thaliana IDI(AAB67741.1 and AAL57687.1)；NtIDI1 and NtIDI2 of Nicotiana tabacum L IDI(BAB40973.1 and BAB40974.1) ；boxes show the residues that are critical for the catalytic activities of the enzyme

圖4 CsIDI1和CsIDI2與其他植物IDI1、IDI2氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of CsIDI1, CsIDI2 and IDI1, IDI2 in other plants

2.5.2CsIDI1和CsIDI2基因在不同茶樹(shù)品種中的表達(dá)模式分析在黃旦與鐵觀音2個(gè)品種茶樹(shù)及以兩者為父母本的雜交后代(金玫瑰、金牡丹、金觀音和黃觀音4個(gè)高香型烏龍茶茶樹(shù)品種)中，CsIDI1和CsIDI2相對(duì)表達(dá)量在品種間存在顯著差異。結(jié)果顯示，CsIDI1和CsIDI2在母本鐵觀音品種中的相對(duì)表達(dá)量最低，在父本黃旦品種中的相對(duì)表達(dá)量?jī)H次于最高；而CsIDI1和CsIDI2相對(duì)表達(dá)量都在雜交后代品種茶樹(shù)中表現(xiàn)最高，并達(dá)到極顯著差異水平，CsIDI1在金牡丹品種中的相對(duì)表達(dá)量最高，是鐵觀音中CsIDI1的4.67倍，CsIDI2在黃觀音品種中相對(duì)表達(dá)量最高，是鐵觀音中CsIDI2的2.28倍；整體差異趨勢(shì)表現(xiàn)為CsIDI1和CsIDI2相對(duì)表達(dá)量在父本黃旦品種及雜交后代品種中較高，極顯著高于母本鐵觀音品種。CsIDI1表達(dá)水平從高到低依次為：金牡丹>金玫瑰>金觀音>黃旦>黃觀音>鐵觀音；CsIDI2表達(dá)水平從高到低依次為：黃觀音>黃旦>金玫瑰>金觀音>金牡丹>鐵觀音(圖5，B)。

2.5.3CsIDI1和CsIDI2在烏龍茶搖青過(guò)程的表達(dá)模式分析在烏龍茶做青過(guò)程中，茶樹(shù)葉片離體新梢經(jīng)歷了組織損傷、光照輻射等非生物脅迫后激活茶樹(shù)CsIDI1和CsIDI2的轉(zhuǎn)錄，CsIDI1和CsIDI2在烏龍茶做青過(guò)程中均有表達(dá)，且表達(dá)受到不同程度的誘導(dǎo)，但CsIDI2的表達(dá)量豐度顯著高于CsIDI1。在烏龍茶做青過(guò)程中，CsIDI2表達(dá)量從鮮葉、曬青、一搖到三搖的相對(duì)表達(dá)量逐步上升，三搖時(shí)的CsIDI2相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高值，是鮮葉中CsIDI2表達(dá)量的16.53倍，顯著高于其他時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量；CsIDI1的相對(duì)表達(dá)量變化呈現(xiàn)相同趨勢(shì)，三搖時(shí)的CsIDI1相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高值，是鮮葉中CsIDI1表達(dá)量的1.34倍，顯著高于其他時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量，但沒(méi)有CsIDI2變化明顯(圖5，C)。

不同小寫字母表示顯著差異水平(P<0.05)和CsIDI2的相對(duì)表達(dá)量The normal letters indicate significant difference at 0.05 level

3 討 論

5-碳化合物異戊烯基焦磷酸(IPP)和它的異構(gòu)物二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)是萜類化合物合成的中心化合物和重要前體分子，它們是經(jīng)典的MEP/MVA途徑的產(chǎn)物，兩者在異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(IDI)的作用下可以相互轉(zhuǎn)化。已有研究表明，擬南芥和煙草中只含有2個(gè)IDI基因(AtIDI1、AtIDI2和NtIDI1、NtIDI2)，它們高度保守，已知的IDI都有高度保守的NUDIX水解酶域[7]，但I(xiàn)DI1比IDI2在N-端都多出一段氨基酸片段，兩者都能編碼具有類似N-端延伸的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)肽，并在所有器官中表達(dá)。目前在茶樹(shù)中，對(duì)萜類代謝途徑中DXS、DXR、TPS、MVD等關(guān)鍵酶基因展開(kāi)了基因克隆和功能鑒定，但對(duì)IDI基因在茶樹(shù)萜類香氣形成中的作用研究還未有[17-21]。本研究克隆得到2個(gè)茶樹(shù)異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶基因，CsIDI1和CsIDI2，分別編碼297和238個(gè)氨基酸，CsIDI1在N端比CsIDI2多59個(gè)氨基酸片段，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)位于葉綠體上，因此推測(cè)CsIDI1屬于位于MEP途徑上的一類定位于質(zhì)體上的IDI基因。而CsIDI2亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)位于細(xì)胞質(zhì)上，因此推測(cè)CsIDI2屬于位于MVA途徑上的一類定位于細(xì)胞質(zhì)上的IDI基因。CsIDI1和CsIDI2亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)與擬南芥的IDI基因家族的兩條序列相同，為后續(xù)的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)提供觀察位點(diǎn)依據(jù)。

CsIDI1和CsIDI2基因的組織表達(dá)特異性分析表明，基因在茶樹(shù)地上部位的組織器官中都有表達(dá)，但CsIDI1和CsIDI2的組織特異性表達(dá)存在差異，兩者在茶樹(shù)葉中表達(dá)量都較高。在茶葉加工對(duì)茶樹(shù)葉片的損傷脅迫中，CsIDI1和CsIDI2基因在葉片、莖中的組織表達(dá)特異性有利于萜類特征物質(zhì)的形成和積累。本研究選取了黃旦與鐵觀音2個(gè)品種茶樹(shù)以及兩者為父母本的雜交后代，分析CsIDI1和CsIDI2在不同茶樹(shù)品種間及親子代間的表達(dá)差異。結(jié)果表明CsIDI1和CsIDI2 4個(gè)高香型雜家后代茶樹(shù)品種中的表達(dá)量，都極顯著高于母本鐵觀音品種，表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢(shì)[22]。在實(shí)際生產(chǎn)中，選用父本黃旦及雜交后代加工的烏龍茶香氣更高揚(yáng)，呈現(xiàn)“透天香”香氣特征。因此，本研究獲得的CsIDI1和CsIDI2基因在高香型茶樹(shù)品種選育中也具有一定的指導(dǎo)意義。研究表明做青是烏龍茶香氣風(fēng)味品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序，促進(jìn)了萜類香氣物質(zhì)的積累，其中倍半萜的反式-橙花叔醇及α-法呢烯、單萜的芳樟醇及其氧化物等萜類化合物是烏龍茶中檢測(cè)到的主要香氣組分，香味閾值低[23-24]，因此推測(cè)，選育的不同茶樹(shù)品種萜類代謝合成途徑中IDI的表達(dá)差異量在烏龍茶加工中呈現(xiàn)出不同香氣特征過(guò)程中發(fā)揮了作用。本研究結(jié)果表明，CsIDI1和CsIDI2在烏龍茶做青過(guò)程中均有表達(dá)且表達(dá)受到不同程度的誘導(dǎo)，CsIDI2比CsIDI1相對(duì)表達(dá)量變化顯著。在烏龍茶做青過(guò)程中，CsIDI2表達(dá)量從鮮葉、曬青、一搖到三搖的相對(duì)表達(dá)量逐步上升。這與Zeng等[16]研究結(jié)果相似，在烏龍茶重要香氣物質(zhì)吲哚的合成中，關(guān)鍵基因CsTSB2在烏龍茶做青過(guò)程中的表達(dá)呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，并伴隨吲哚的含量積累。徐燕[25]研究了萜類代謝途徑HMGR、DXR、GGPS基因在福鼎大白茶鮮葉在100 μW/cm2的紫外線(UV-B) 處理下萎凋 8 h 過(guò)程中，基因表達(dá)強(qiáng)度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，證明萜類代謝途徑基因在茶葉加工中隨著葉片脅迫的發(fā)生，對(duì)萜類香氣物質(zhì)合成發(fā)揮作用。結(jié)合CsIDI2亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)位于細(xì)胞質(zhì)的MVA途徑中，主要參與合成倍半萜、三萜香氣化合物，推測(cè)茶樹(shù)上CsIDI2在萜類香氣物質(zhì)合成中發(fā)揮更為重要的作用。

在茶樹(shù)萜類物質(zhì)代謝中，單萜、倍半萜等萜類香氣的合成與茶葉的香氣品質(zhì)存在重要聯(lián)系，單萜、倍半萜等萜類香氣化合物的分子生物合成機(jī)理是研究關(guān)注點(diǎn)，因此本研究中克隆并分析了萜類代謝途徑上調(diào)控C5前體五合成的CsIDI1和CsIDI2在茶樹(shù)不同組織、不同茶樹(shù)品種、烏龍茶搖青過(guò)程中的表達(dá)模式，初步確定CsIDI1和CsIDI2參與的萜類香氣化合物合成在茶樹(shù)萜類特征香氣物質(zhì)合成中起到重要作用。CsIDI1和CsIDI2對(duì)茶葉加工過(guò)程中的逆境脅迫響應(yīng)表達(dá)，為后續(xù)研究茶樹(shù)IDI基因家族在茶樹(shù)中的生理功能及香氣形成中的作用提供理論參考，實(shí)現(xiàn)萜類香氣代謝工程提供候選基因和作用靶點(diǎn)。但目標(biāo)基因催化促進(jìn)萜類物質(zhì)合成功能有待通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將其轉(zhuǎn)入楊樹(shù)等模式植物中做深入研究。同時(shí)，CsIDIs還可能參與茶樹(shù)香氣前體物類胡蘿卜素合成，以及CsIDI1和CsIDI2在茶樹(shù)細(xì)胞中IPP和DMAPP之間的碳分配比，兩者均以可變比率用作合成不同細(xì)胞萜類化合物的反應(yīng)物，這種調(diào)節(jié)功能差異，都有待于進(jìn)一步研究。

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